In vitro Methylering Assay til at studere protein Arginin Methylering
Summary
Protein arginin methylering, katalyseret af en klasse af enzymer, nemlig. Protein arginin metyltransferaser (PRMTs), er processen med enzymatisk tilsætning af methyl-gruppe (r) til argininer i proteiner. In vitro methylering analysen er den mest pålidelige redskab til at vurdere status for methylering af kendte eller nye PRMT substrater.
Abstract
Protein arginin methylering er en af de mest rigelige post-translationelle modifikationer i kernen. Protein arginin methylering kan identificeres og / eller bestemmes via proteom tilgange, og / eller immunoblotting med methyl-arginin specifikke antistoffer. Men disse teknikker kan undertiden være vildledende og giver ofte falske positive resultater. Vigtigst er det, kan disse teknikker ikke giver direkte beviser til støtte for den PRMT substrat specificitet. In vitro-methylering assays på den anden side, er nyttige biokemiske analyser, som er følsomme, og konsekvent afsløre, om de identificerede proteiner er faktisk PRMT substrater. En typisk in vitro-methylering assayet omfatter oprensede, aktive PRMTs, renset substrat og en radioaktiv isotop mærket methyldonor (S-adenosyl-L [methyl-3H] methionin). Her beskriver vi en trin-for-trin-protokollen til at isolere katalytisk aktiv PRMT1, en allestedsnærværende udtrykt PRMT familiemedlem. Det migthyl transferase aktiviteter oprensede PRMT1 blev senere testet Ras-GTPase-aktiverende protein-bindende protein 1 (G3BP1), et kendt PRMT substrat, i nærvær af S-adenosyl-L [methyl-3H] methionin som methyl donor. Denne protokol kan anvendes ikke kun til oprettelse status for methylering af nye fysiologiske PRMT1 substrater, men også for at forstå den grundlæggende mekanisme af protein arginin methylering.
Introduction
Protein methylering blev første gang beskrevet i 1968 1. Det var ikke før den første kloning af PRMT1 i 1996, at forskerne begyndte at værdsætte betydningen af denne post-translationel 2 modifikation. Interessant er omkring 2% af argininrester i proteiner af kerneekstrakter methyleret 3, indikerer forekomsten af denne ændring. Arginin er en positivt ladet aminosyre med en basisk sidekæde og nitrogen / s i kæder af arginin side kan være posttranslationelt modificeret ved tilsætning af en methylgruppe, en proces kendt som arginin methylering 4-6. Arginin methylering katalyseres af en klasse af enzymer, nemlig., Protein arginin metyltransferaser (PRMTs). Argininer kan enten monomethylerede eller dimethylerede og sidstnævnte kan enten være symmetrisk eller asymmetrisk afhængigt af PRMTs katalyserer processen 4-6.
Proteiner, der viser arginine-glycinrigt motiver er potentielle mål for PRMT-medieret katalyse. PRMT-medieret methylering af substrater har vist sig at modulere protein-protein-interaktion, protein-nukleinsyre interaktion, proteinfunktion, genekspression og / eller cellulær signalering, som alle er kritiske for normal cellulær homøostase 7-9. For at forstå den biologiske rolle af protein arginin methylering, er præcise, effektive og reproducerbare analyser forpligtet til at fastslå status for methylering af de identificerede PRMT substrater.
In vitro-methylering assay som vurderer evner oprensede PRMTs at katalysere methylering af deres substrater, er et godt accepteret assay for at studere arginin methylering 10-12. Den samlede succes for denne analyse i vid udstrækning afhænger af aktiviteten af de oprensede PRMTs. PRMTs kan udtrykkes og oprenses fra bakterier eller pattedyrceller 10,11. Denne in vitro-methylering assay som dETALJERET i protokollen afsnit er baseret på en metode oprindeligt beskrevet af Tini og kolleger 10. I denne protokol, viser vi i detaljer de trin, der er involveret i ekspression og oprensning af PRMT1 i pattedyrceller. Evnen af det oprensede PRMT1 at katalysere methylering Ras-GTPase-aktiverende protein-bindende protein 1 (G3BP1), et kendt PRMT substrat 8, blev senere undersøgt i nærvær af S-adenosyl-L [methyl-3H] methionin som methyl donor. Ved hjælp af dette assay kan vi pålideligt definere evner PRMTs til methylat roman eller kendte substrater, som er en primær trin i undersøgelsen af protein arginin methylering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den heri beskrevne protokol anvendes rutinemæssigt til at fastslå status for methylering af de identificerede PRMT substrater. Denne robuste, og konsekvent analyse vil også give endegyldige bevis på specificitet PRMTs for deres substrater. De centrale komponenter til succes i denne analyse er: 1. Angivelse af PRMTs i pattedyrceller, 2. Aktivitet af oprensede PRMTs 3. Ekspression og oprensning af substrat, og 4. Komplet vestlige overførsel af proteinerne til nitrocellulosemembranen.
Reko…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev understøttet af en Merit Award fra det amerikanske Department of Veterans Affairs, og en NIH indrømme R01CA138528 til RW.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine | Perkin Elmer | ||
| Ecoscint ultra | National Diagnostics | LS-270 | |
| Bottle top dispenser | National Diagnostics | LS-900 | |
| AutoFluor | National Diagnostics | LS-315 | |
| 6 ml Scintillation Vials | National Diagnostics | SKU:SVC-06 | |
| GST-sepharose | GE Life Sciences | ||
| L-Glutathione Reduced | Sigma | G4251 | |
| Lipofectamine | Invitrogen | Transfection reagent | |
| Beas2B | ATCC | ||
| Optimem | Invitrogen | ||
| NP-40 | US-Biologicals | ||
| SDS | Sigma | ||
| Sodium deoxycholate | Sigma | ||
| PMSF | Sigma | ||
| anti-HA affinity matrix | Roche | ||
| Tris | Sigma | ||
| Nacl | Sigma | ||
| Bio-rad gel doc | Bio Rad | ||
| anti-HA antibody | roche | ||
| Ponseau S | Fisher Scientific |
Referências
- Paik, W. K., Kim, S. Protein methylase I. Purification and properties of the enzyme. J Biol Chem. 243, 2108-2114 (1968).
- Lin, W. J., Gary, J. D., Yang, M. C., Clarke, S., Herschman, H. R. The mammalian immediate-early TIS21 protein and the leukemia-associated BTG1 protein interact with a protein-arginine N-methyltransferase. J Biol Chem. 271, 15034-15044 (1996).
- Boffa, L. C., Karn, J., Vidali, G., Allfrey, V. G. Distribution of NG, NG,-dimethylarginine in nuclear protein fractions. Biochem Biophys Res Commun. 74, 969-976 (1977).
- Bedford, M. T. Arginine methylation at a glance. J Cell Sci. 120, 4243-4246 (2007).
- Lee, Y. H., Stallcup, M. R. Minireview: protein arginine methylation of nonhistone proteins in transcriptional regulation. Mol Endocrinol. 23, 425-433 (2009).
- Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Mol Cell. 33, 1-13 (2009).
- Bikkavilli, R. K., et al. Dishevelled3 is a novel arginine methyl transferase substrate. Scientific reports. 2, 805 (2012).
- Bikkavilli, R. K., Malbon, C. C. Arginine methylation of G3BP1 in response to Wnt3a regulates {beta}-catenin mRNA. J Cell Sci. 124, 2310-2320 (2011).
- Bikkavilli, R. K., Malbon, C. C. Wnt3a-stimulated LRP6 phosphorylation is dependent upon arginine methylation of G3BP2. J Cell Sci. , (2012).
- Tini, M., Naeem, H., Torchia, J. Biochemical analysis of arginine methylation in transcription. Methods Mol Biol. 523, 235-247 (2009).
- Lee, J., Cheng, D., Bedford, M. T. Techniques in protein methylation. Methods Mol Biol. 284, 195-208 (2004).
- Cheng, D., Vemulapalli, V., Bedford, M. T. Methods applied to the study of protein arginine methylation. Methods Enzymol. 512, 71-92 (2012).
- Zurita-Lopez, C. I., Sandberg, T., Kelly, R., Clarke, S. G. Human protein arginine methyltransferase 7 (PRMT7) is a type III enzyme forming omega-NG-monomethylated arginine residues. J Biol Chem. 287, 7859-7870 (2012).
