In vitro test de Méthylation à étudier des protéines méthylation de l'arginine
Summary
Protéine méthylation de l'arginine, catalysée par une classe d'enzymes à savoir. Protéine arginine méthyl transférases (en PRMT), est le processus d'addition enzymatique de groupe (s) méthyle arginines à l'intérieur des protéines. Le test de méthylation in vitro est l'outil le plus fiable pour évaluer l'état de méthylation de substrats connus ou nouveaux PRMT.
Abstract
Protéine méthylation de l'arginine est l'une des modifications post-traductionnelles les plus abondants dans le noyau. Protéine méthylation de l'arginine peut être identifié et / ou déterminé par l'intermédiaire d'approches de protéomique, et / ou immunotransfert avec des anticorps spécifiques méthyl-arginine. Cependant, ces techniques peuvent parfois être trompeuses et fournissent souvent des résultats faussement positifs. Plus important encore, ces techniques ne peuvent pas fournir une preuve directe à l'appui de la spécificité de substrat de PRMT. Des essais in vitro de méthylation, d'autre part, sont des dosages biochimiques utiles, qui sont sensibles, et révèlent systématiquement si les protéines identifiées sont en effet des substrats PRMT. Un dosage typique de méthylation in vitro, comprenant PRMT actives purifiées substrat purifié, et un radio-isotope marqué donneur de méthyle (S-adénosyl-L-[méthyl-3H] methionine). Nous décrivons ici un protocole étape par étape pour isoler PRMT1 activité catalytique, un membre de la famille de PRMT exprimé de façon ubiquitaire. Le moiThyl activités de transferase de la PRMT1 purifiés ont ensuite été testés sur Ras-GTPase activant la protéine de liaison 1 (G3BP1) protéine, un substrat de PRMT connu, en présence de S-adénosyl-L-[méthyl-3H] methionine en tant que donneur de méthyle. Ce protocole peut être utilisé non seulement pour l'établissement de l'état de méthylation de nouveaux substrats de PRMT1 physiologiques, mais également pour la compréhension du mécanisme de base de la méthylation de l'arginine protéine.
Introduction
Méthylation des protéines a été décrite pour la première en 1968 1. Ce n'est que le premier clonage d'PRMT1 en 1996, que les chercheurs ont commencé à comprendre l'importance de cette modification post-traductionnelle 2. Fait intéressant, environ 2% des résidus arginine dans les protéines d'extraits nucléaires sont méthylés 3, ce qui indique l'abondance de cette modification. L'arginine est un acide aminé chargé positivement avec une chaîne latérale de base et la teneur en azote / s dans les chaînes latérales de l'arginine peut être modifié après la traduction par l'intermédiaire de l'addition d'un groupe méthyle, un processus connu comme l'arginine méthylation 6.4. Arginine méthylation est catalysée par une classe d'enzymes à savoir. Protéine transférases, méthyle arginine (PRMT). Arginines peuvent être soit monométhylées ou diméthylées et celui-ci peut être soit symétrique ou asymétrique selon le type de PRMT catalysant le procédé 4-6.
Les protéines qui présentent arginineriches motifs de e-glycine sont des cibles potentielles pour la catalyse de PRMT médiation. méthylation de PRMT médiée par des substrats a été montré pour moduler l'interaction protéine-protéine, une interaction protéine-acide nucléique, la fonction des protéines, l'expression des gènes, et / ou de signalisation cellulaire, qui sont critiques pour l'homéostasie cellulaire normale 7-9. Afin de comprendre le rôle biologique de la protéine méthylation de l'arginine, les dosages précis, efficaces et reproductibles sont nécessaires pour établir le statut de méthylation des substrats de PRMT identifiés.
En test de méthylation in vitro, qui évalue les capacités de PRMT purifiées à catalyser la méthylation de leurs substrats, est un test bien accepté pour étudier la méthylation de l'arginine 10-12. Le succès global de ce dosage dépend largement de l'activité des PRMT purifiés. PRMT peuvent être exprimées et purifiées à partir de bactéries ou de cellules de mammifères, 10,11. Ce dosage in vitro de la méthylation, comme detailed dans la partie protocole, est basée sur un procédé décrit à l'origine par Tini et collègues 10. Dans ce protocole, on montre en détail les étapes intervenant dans l'expression et la purification de PRMT1 dans des cellules de mammifères. La capacité de la PRMT1 purifiée pour catalyser la méthylation de Ras-GTPase activating protein protéine de liaison 1 (G3BP1), un substrat connu PRMT 8, a ensuite été évaluée en présence de S-adénosyl-L-[méthyl-3H] methionine en tant que donneur de méthyle. En utilisant ce dosage, on peut définir de manière fiable les capacités des PRMT à nouveau le méthylate ou substrats connus, ce qui est une étape primordiale dans l'étude de la protéine méthylation de l'arginine.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ici est couramment utilisée pour établir le statut de méthylation des substrats de PRMT identifiés. Ce test robuste et cohérente sera également apporter la preuve définitive de la spécificité de PRMT pour leurs substrats. Les éléments clés pour la réussite de ce test sont les suivants: 1 Expression de PRMT dans les cellules de mammifères, 2 Activité de PRMT purifiées, 3 Expression et purification de substrat, et 4 transfert occidentale complète des protéines de la membrane de nitro…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été soutenue par un prix d'excellence du ministère américain des Anciens Combattants, et une subvention du NIH R01CA138528 à RW.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine | Perkin Elmer | ||
| Ecoscint ultra | National Diagnostics | LS-270 | |
| Bottle top dispenser | National Diagnostics | LS-900 | |
| AutoFluor | National Diagnostics | LS-315 | |
| 6 ml Scintillation Vials | National Diagnostics | SKU:SVC-06 | |
| GST-sepharose | GE Life Sciences | ||
| L-Glutathione Reduced | Sigma | G4251 | |
| Lipofectamine | Invitrogen | Transfection reagent | |
| Beas2B | ATCC | ||
| Optimem | Invitrogen | ||
| NP-40 | US-Biologicals | ||
| SDS | Sigma | ||
| Sodium deoxycholate | Sigma | ||
| PMSF | Sigma | ||
| anti-HA affinity matrix | Roche | ||
| Tris | Sigma | ||
| Nacl | Sigma | ||
| Bio-rad gel doc | Bio Rad | ||
| anti-HA antibody | roche | ||
| Ponseau S | Fisher Scientific |
Referências
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