במבחנה מתילציה Assay ללמוד מתילציה ארגינין חלבון
Summary
מתילציה ארגינין חלבון, מזורז על ידי כיתה של אנזימים דהינו., מתיל ארגינין חלבון transferases (PRMTs), הוא התהליך של בנוסף האנזימטית של קבוצה מתיל (ים) לarginines בתוך חלבונים. במבחנה assay מתילציה הוא הכלי האמין ביותר להערכת מצב מתילציה של מצעי PRMT ידועים או רומן.
Abstract
מתילציה ארגינין חלבון היא אחד מהשינויים שלאחר translational הנפוצים ביותר בגרעין. מתילציה ארגינין חלבון יכולה להיות מזוהה ו / או שנקבעה באמצעות גישות proteomic, ו / או immunoblotting עם נוגדנים ספציפיים מתיל-ארגינין. עם זאת, טכניקות אלה לפעמים יכולות להיות מטעות, ולעתים קרובות מספקות תוצאות חיוביות כוזבות. והכי חשוב, בטכניקות אלה אינם יכולים לספק ראיות ישירות לתמיכה בסגוליות מצע PRMT. במבחנה מבחני מתילציה, לעומת זאת, הם מבחני ביוכימיים שימושיים, שהם רגישים, ולחשוף באופן עקבי אם החלבונים שזוהו הם אכן מצעי PRMT. Assay מתילציה טיפוסי במבחנה כולל PRMTs מטוהר, פעיל, מצע מטוהר ותורם רדיואיזוטופים שכותרתו מתיל (S-adenosyl-L- [methyl- 3 H] מתיונין). כאן אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד כדי לבודד PRMT1 הפעילו כקטליזאטור, בן משפחת PRMT הביע כל מקום בגוף. שליפעילויות transferase thyl של PRMT1 המטוהר נבדקו מאוחר יותר על חלבון ראס-GTPase הפעלת חלבון מחייב 1 (G3BP1), מצע PRMT ידוע, בנוכחות S-adenosyl-L- [methyl- 3 H] מתיונין כתורם מתיל. פרוטוקול זה יכול להיות מועסק לא רק להקמת מעמד מתילציה של מצעי PRMT1 פיסיולוגיים רומן, אלא גם להבנת המנגנון הבסיסי של מתילציה ארגינין החלבון.
Introduction
מתילציה החלבון תוארה לראשונה בשנת 1968 1. זה לא היה עד השיבוט הראשון של PRMT1 ב -1996, כי חוקרים החלו להעריך את החשיבות של שינוי שלאחר translational זה 2. מעניין, כ -2% משאריות ארגינין בחלבונים של תמציות גרעיניות מפוגלים 3, המציינים את השפע של שינוי זה. ארגינין הוא חומצת אמינו טעונה חיובי עם צד שרשרת בסיסית והחנקן / s בתוך הרשתות בצד של ארגינין יכול להיות שלאחר translationally שונה באמצעות התוספת של קבוצה מתיל, תהליך המכונה מתילציה ארגינין 4-6. מתילציה ארגינין היא מזורזת על ידי כיתה של אנזימים דהינו., transferases תיל ארגינין חלבון (PRMTs). יכול גם להיות monomethylated Arginines או dimethylated והאחרון יכול להיות או סימטרי או לא סימטרי, תלוי בסוג של PRMTs מזרזות התהליך 4-6.
חלבונים המציגים argininמוטיבים עשירים דואר גליצין הם יעדים פוטנציאליים לקטליזה בתיווך PRMT. מתילציה בתיווך PRMT של מצעים הוכח לווסת אינטראקציה בין חלבונים, אינטראקציה חומצת חלבון גרעין, תפקוד חלבון, ביטוי גנים, ו / או איתות תאית, כל אלה הם הגורמים קריטיים להומאוסטזיס סלולארי רגיל 7-9. על מנת להבין את התפקיד הביולוגי של מתילציה ארגינין חלבון, מבחני מדויקים, יעיל, לשחזור נדרשים לביסוס מעמדה מתילציה של מצעי PRMT המזוהים.
ב assay מתילציה מבחנה, המעריך את היכולות של PRMTs מטוהר לזרז מתילציה של מצעים שלהם, הוא assay מקובל היטב ללימוד מתילציה ארגינין 10-12. ההצלחה הכוללת של assay זה תלוי במידה רבה על הפעילות של PRMTs המטוהר. ניתן לבטא PRMTs ומטוהר מחיידקים, או תאי יונקים 10,11. assay זה במבחנה מתילציה, כמו דetailed בסעיף הפרוטוקול, מבוסס על שיטה המתוארת במקור על ידי Tini ועמיתים 10. בפרוטוקול זה, אנו מראים בפירוט את השלבים כרוכים בביטוי והטיהור של PRMT1 בתאי יונקים. היכולת של PRMT1 המטוהר לזרז מתילציה בראס-GTPase הפעלת חלבון מחייב חלבון 1 (G3BP1), מצע PRMT ידוע 8, מאוחר יותר העריכה בנוכחות מתיונין S-adenosyl-L- [methyl- 3 ח] כ תורם מתיל. שימוש assay זה, אנו יכולים באופן מהימן להגדיר את היכולות של PRMTs לרומן methylate או מצעים ידועים, שבו הוא צעד ראשוני במחקר של מתילציה ארגינין החלבון.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר במסמך זה משמש באופן שגרתי לביסוס מעמדה מתילציה של מצעי PRMT המזוהים. assay חזק, ועולה בקנה אחד זה יהיה גם לספק ראיות מוחלטות על הספציפיות של PRMTs למצעים שלהם. רכיבי מפתח להצלחה של assay זה הם: .1 ביטוי של PRMTs בתאי יונקים, 2 פעילות של PRMTs המטוהר, 3 ביטוי וטיהור של מצ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי פרס הצטיינות ממשרד החוץ האמריקאי לענייני יוצאי צבא, וNIH להעניק R01CA138528 לRW.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine | Perkin Elmer | ||
| Ecoscint ultra | National Diagnostics | LS-270 | |
| Bottle top dispenser | National Diagnostics | LS-900 | |
| AutoFluor | National Diagnostics | LS-315 | |
| 6 ml Scintillation Vials | National Diagnostics | SKU:SVC-06 | |
| GST-sepharose | GE Life Sciences | ||
| L-Glutathione Reduced | Sigma | G4251 | |
| Lipofectamine | Invitrogen | Transfection reagent | |
| Beas2B | ATCC | ||
| Optimem | Invitrogen | ||
| NP-40 | US-Biologicals | ||
| SDS | Sigma | ||
| Sodium deoxycholate | Sigma | ||
| PMSF | Sigma | ||
| anti-HA affinity matrix | Roche | ||
| Tris | Sigma | ||
| Nacl | Sigma | ||
| Bio-rad gel doc | Bio Rad | ||
| anti-HA antibody | roche | ||
| Ponseau S | Fisher Scientific |
Referências
- Paik, W. K., Kim, S. Protein methylase I. Purification and properties of the enzyme. J Biol Chem. 243, 2108-2114 (1968).
- Lin, W. J., Gary, J. D., Yang, M. C., Clarke, S., Herschman, H. R. The mammalian immediate-early TIS21 protein and the leukemia-associated BTG1 protein interact with a protein-arginine N-methyltransferase. J Biol Chem. 271, 15034-15044 (1996).
- Boffa, L. C., Karn, J., Vidali, G., Allfrey, V. G. Distribution of NG, NG,-dimethylarginine in nuclear protein fractions. Biochem Biophys Res Commun. 74, 969-976 (1977).
- Bedford, M. T. Arginine methylation at a glance. J Cell Sci. 120, 4243-4246 (2007).
- Lee, Y. H., Stallcup, M. R. Minireview: protein arginine methylation of nonhistone proteins in transcriptional regulation. Mol Endocrinol. 23, 425-433 (2009).
- Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Mol Cell. 33, 1-13 (2009).
- Bikkavilli, R. K., et al. Dishevelled3 is a novel arginine methyl transferase substrate. Scientific reports. 2, 805 (2012).
- Bikkavilli, R. K., Malbon, C. C. Arginine methylation of G3BP1 in response to Wnt3a regulates {beta}-catenin mRNA. J Cell Sci. 124, 2310-2320 (2011).
- Bikkavilli, R. K., Malbon, C. C. Wnt3a-stimulated LRP6 phosphorylation is dependent upon arginine methylation of G3BP2. J Cell Sci. , (2012).
- Tini, M., Naeem, H., Torchia, J. Biochemical analysis of arginine methylation in transcription. Methods Mol Biol. 523, 235-247 (2009).
- Lee, J., Cheng, D., Bedford, M. T. Techniques in protein methylation. Methods Mol Biol. 284, 195-208 (2004).
- Cheng, D., Vemulapalli, V., Bedford, M. T. Methods applied to the study of protein arginine methylation. Methods Enzymol. 512, 71-92 (2012).
- Zurita-Lopez, C. I., Sandberg, T., Kelly, R., Clarke, S. G. Human protein arginine methyltransferase 7 (PRMT7) is a type III enzyme forming omega-NG-monomethylated arginine residues. J Biol Chem. 287, 7859-7870 (2012).
