इन विट्रो मेथिलिकरण परख में प्रोटीन Arginine मेथिलिकरण अध्ययन
Summary
प्रोटीन arginine मेथिलिकरण, एंजाइमों अर्थात के एक वर्ग द्वारा उत्प्रेरित., प्रोटीन arginine मिथाइल transferases (PRMTs), प्रोटीन के भीतर arginines को मिथाइल समूह (एस) के enzymatic अलावा की प्रक्रिया है. इन विट्रो मेथिलिकरण परख ज्ञात या उपन्यास PRMT substrates के मेथिलिकरण स्थिति का आकलन करने के लिए सबसे भरोसेमंद उपकरण है.
Abstract
प्रोटीन arginine मेथिलिकरण नाभिक में सबसे प्रचुर बाद translational संशोधनों में से एक है. प्रोटीन arginine मेथिलिकरण पहचान और / या प्रोटिओमिक दृष्टिकोण के माध्यम से निर्धारित किया, और / या मिथाइल-arginine विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ Immunoblotting किया जा सकता है. हालांकि, इन तकनीकों कभी कभी भ्रामक हो सकते हैं और अक्सर झूठी सकारात्मक परिणाम प्रदान करते हैं. सबसे महत्वपूर्ण बात, इन तकनीकों मेथिलिकरण assays, दूसरी ओर, संवेदनशील होते हैं जो उपयोगी जैव रासायनिक assays, हैं इन विट्रो. PRMT सब्सट्रेट विशिष्टता के समर्थन में प्रत्यक्ष सबूत नहीं प्रदान कर सकते हैं, और पहचान प्रोटीन वास्तव में PRMT substrates हैं अगर लगातार प्रकट करते हैं. एक ठेठ इन विट्रो मेथिलिकरण परख शुद्ध, सक्रिय PRMTs, शुद्ध सब्सट्रेट और एक रेडियो आइसोटोप लेबल मिथाइल दाता (एस adenosyl-एल [methyl- 3 एच] methionine) शामिल हैं. यहाँ हम catalytically सक्रिय PRMT1, एक सर्वत्र व्यक्त PRMT परिवार के सदस्य अलग करने के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल का वर्णन. मुझेशुद्ध PRMT1 की thyl ट्रांस्फ़्रेज़ गतिविधियों बाद में एस adenosyl-एल मिथाइल दाता के रूप में [methyl- 3 एच] methionine की उपस्थिति में, प्रोटीन 1 (G3BP1) बाध्यकारी रास-GTPase को सक्रिय प्रोटीन, एक ज्ञात PRMT सब्सट्रेट पर परीक्षण किया गया. इस प्रोटोकॉल उपन्यास शारीरिक PRMT1 substrates के मेथिलिकरण स्थिति स्थापित करने के लिए, लेकिन यह भी प्रोटीन arginine मेथिलिकरण के बुनियादी तंत्र को समझने के लिए न केवल रोजगार प्राप्त किया जा सकता है.
Introduction
प्रोटीन मेथिलिकरण पहले 1968 1 में वर्णित किया गया था. यह शोधकर्ताओं 2 इस बाद translational संशोधन के महत्व की सराहना करने के लिए शुरू किया है कि 1996 में PRMT1 की पहली क्लोनिंग तक नहीं था. दिलचस्प बात यह है कि परमाणु अर्क के प्रोटीन में arginine अवशेषों के बारे में 2% इस संशोधन की बहुतायत का संकेत, 3 methylated रहे हैं. Arginine हो सकता है arginine के पक्ष श्रृंखला के भीतर एक बुनियादी पक्ष श्रृंखला और नाइट्रोजन / एस के साथ एक सकारात्मक आरोप लगाया एमिनो एसिड होता है के बाद translationally एक मिथाइल समूह, arginine मेथिलिकरण 4-6 के रूप में जाना जाता प्रक्रिया के अलावा के माध्यम से संशोधित. Arginine मेथिलिकरण एंजाइमों अर्थात के एक वर्ग द्वारा उत्प्रेरित कर रहा है., प्रोटीन arginine मिथाइल transferases (PRMTs). Arginines monomethylated या dimethylated और बाद की प्रक्रिया 4-6 उत्प्रेरित PRMTs के प्रकार पर निर्भर करता है सममित या विषम या तो हो सकता है हो सकता है.
Arginin प्रदर्शित प्रोटीन है किई ग्लाइसिन अमीर रूपांकनों PRMT की मध्यस्थता कटैलिसीस के लिए संभावित लक्ष्य हैं. Substrates के PRMT की मध्यस्थता मेथिलिकरण सामान्य सेलुलर homeostasis 7-9 के लिए महत्वपूर्ण हैं, जो सभी के प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत, प्रोटीन न्यूक्लिक एसिड बातचीत, प्रोटीन समारोह, जीन अभिव्यक्ति, और / या सेलुलर संकेत, व्यवस्थित करने के लिए दिखाया गया है. प्रोटीन arginine मेथिलिकरण की जैविक भूमिका को समझने के लिए, सटीक, कुशल, और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य assays पहचान PRMT substrates के मेथिलिकरण स्थिति स्थापित करने के लिए आवश्यक हैं.
उनके substrates के मेथिलिकरण को उत्प्रेरित करने के लिए शुद्ध PRMTs की क्षमताओं का मूल्यांकन करता है, जो इन विट्रो मेथिलिकरण परख, में, arginine मेथिलिकरण 10-12 के अध्ययन के लिए एक अच्छी तरह से स्वीकार कर लिया परख है. इस परख के समग्र सफलता काफी हद तक शुद्ध PRMTs की गतिविधि पर निर्भर करता है. PRMTs व्यक्त की और बैक्टीरिया, या स्तनधारी कोशिकाओं 10,11 से शुद्ध किया जा सकता है. डी के रूप में यह इन विट्रो मेथिलिकरण परख,प्रोटोकॉल अनुभाग में etailed, मूल रूप Tini और उनके सहयोगियों ने 10 से वर्णित एक विधि पर आधारित है. इस प्रोटोकॉल में, हम विस्तार में स्तनधारी कोशिकाओं में PRMT1 की अभिव्यक्ति और शोधन में शामिल कदम दिखा. प्रोटीन बाध्यकारी प्रोटीन 1 (G3BP1), एक ज्ञात PRMT सब्सट्रेट 8, को सक्रिय रास-GTPase पर मेथिलिकरण को उत्प्रेरित करने के लिए शुद्ध PRMT1 की क्षमता बाद में के रूप में एस adenosyl-एल [methyl- 3 एच] methionine की उपस्थिति में मूल्यांकन किया गया था मिथाइल दाता. इस परख का उपयोग करना, हम मज़बूती से प्रोटीन arginine मेथिलिकरण के अध्ययन में एक प्राथमिक कदम है जो methylate उपन्यास या ज्ञात substrates, को PRMTs की क्षमताओं को परिभाषित कर सकते हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल नियमित पहचान PRMT substrates के मेथिलिकरण स्थिति स्थापित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. यह मजबूत है, और लगातार परख भी उनके substrates के लिए PRMTs की विशिष्टता पर निश्चित सबूत प्रदान करेगा. …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन दिग्गजों मामलों के अमेरिकी विभाग से एक मेरिट पुरस्कार द्वारा समर्थित है, और एक एनआईएच आरडब्ल्यू को R01CA138528 अनुदान दिया गया था.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine | Perkin Elmer | ||
| Ecoscint ultra | National Diagnostics | LS-270 | |
| Bottle top dispenser | National Diagnostics | LS-900 | |
| AutoFluor | National Diagnostics | LS-315 | |
| 6 ml Scintillation Vials | National Diagnostics | SKU:SVC-06 | |
| GST-sepharose | GE Life Sciences | ||
| L-Glutathione Reduced | Sigma | G4251 | |
| Lipofectamine | Invitrogen | Transfection reagent | |
| Beas2B | ATCC | ||
| Optimem | Invitrogen | ||
| NP-40 | US-Biologicals | ||
| SDS | Sigma | ||
| Sodium deoxycholate | Sigma | ||
| PMSF | Sigma | ||
| anti-HA affinity matrix | Roche | ||
| Tris | Sigma | ||
| Nacl | Sigma | ||
| Bio-rad gel doc | Bio Rad | ||
| anti-HA antibody | roche | ||
| Ponseau S | Fisher Scientific |
Referências
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