タンパク質アルギニンメチル化を研究するためのin vitroでメチル化アッセイで
Summary
タンパク質アルギニンメチル化酵素、すなわちクラスによって触媒。、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ（PRMTs）は、タンパク質内のアルギニンのメチル基の酵素添加の過程である。 インビトロメチル化アッセイは、既知または新規のPRMT基質のメチル化状態を評価するための最も信頼できるツールである。
Abstract
タンパク質アルギニンメチル化は、核内で最も豊富な翻訳後修飾の一つである。タンパク質アルギニンメチル化は、識別および/または決定プロテオミクスのアプローチを介して、および/またはメチル-アルギニン特異的抗体を用いたイムノブロッティングすることができる。しかしながら、これらの技術は、時には誤解を招くことがあり、しばしば、偽陽性の結果を与えることができる。最も重要なことは、これらの技術は、PRMTの基質特異性を支持する直接的な証拠を提供することができない。 インビトロメチル化アッセイ、一方、敏感である有用な生化学的ア ッセイであり、同定されたタンパク質が実際にPRMT基質である場合には一貫して明らかにした。典型的なインビトロメチル化アッセイは、精製され、アクティブPRMTs、精製された基板と、放射性同位体標識されたメチル供与体（S-アデノシル-L-[メチル- 3 H]メチオニン）が含まれています。ここでは、触媒的に活性なPRMT1、普遍的に発現PRMTファミリーメンバーを単離するためにステップバイステップのプロトコルを記述します。私に精製PRMT1のメチルトランスフェラーゼ活性は、後でS-アデノシル-L-メチル供与体としての[メチル- 3 H]メチオニンの存在下で、タンパク質1（G3BP1）に結合Rasは、GTPアーゼ活性化タンパク質、既知のPRMT基板上に試験した。このプロトコルは、新たな生理PRMT1基質のメチル化状態を確立するためだけでなく、タンパク質アルギニンメチル化の基本的なメカニズムを理解するためだけでなく、使用することができる。
Introduction
タンパク質のメチル化は、最初に1968年1に記載された。それは、研究者は、この翻訳後修飾2の重要性を認めるようになったことを、1996年にPRMT1の最初のクローニングまでではなかった。興味深いことに、核抽出物のタンパク質中のアルギニン残基の約2％は、本変形例の存在量を示す、3メチル化されている。アルギニンは、塩基性側鎖を有するアミノ酸を正に帯電している窒素/ sのアルギニンの側鎖中には、翻訳後にメチル基、アルギニンのメチル化4-6として知られているプロセスの添加によって修飾することができる。アルギニンメチル化は、酵素、すなわちクラスによって触媒される。、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ（PRMTs）。アルギニンはモノメチル化またはジメチル化し、後者は、工程4-6を触媒PRMTsの種類に応じて、対称または非対称のいずれかであり得ることがことができます。
アルギニンを表示するタンパク質電子グリシンリッチモチーフはPRMT媒介触媒作用のための潜在的標的である。基質のPRMT媒介メチル化は、正常な細胞ホメオスタシス7-9に重要である全てが、タンパク質-タンパク質相互作用、タンパク質-核酸相互作用、タンパク質機能、遺伝子発現、および/ または細胞内シグナル伝達を調節することが示されている。タンパク質アルギニンメチル化の生物学的役割を理解するために、正確で効率的かつ再現可能なアッセイを同定PRMT基質のメチル化状態を確立するために必要とされる。
それらの基質のメチル化を触媒する精製PRMTsの能力を評価するインビトロメチル化アッセイでは 、アルギニンメチル化10-12を研究するための広く受け入れられアッセイである。このアッセイの全体的な成功は、主に精製されたPRMTsの活性に依存している。 PRMTsを発現させ、細菌、または哺乳動物細胞10,11から精製することができる。 dと、このインビトロメチル化アッセイ、プロトコルセクションでetailed、もともとチニと同僚10によって記載された方法に基づいている。このプロトコルでは、詳細には哺乳動物細胞におけるPRMT1の発現および精製に関与するステップを示す。タンパク質結合タンパク質1（G3BP1）、既知のPRMT基板8を 、活性化はRas-GTPアーゼ上のメチル化を触媒する精製PRMT1の能力は、後述のようなS-アデノシル-L-[メチル- 3 H]メチオニンの存在下で評価した。メチル供与体。このアッセイを用いて、確実に、タンパク質アルギニンメチル化の研究における主要なステップであるメチ小説や既知の基質にPRMTsの能力を定義することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
本明細書に記載のプロトコルは、日常的に同定PRMT基質のメチル化状態を確立するために使用される。この強力、かつ一貫性のアッセイはまた、それらの基質のためのPRMTsの特異性に決定的な証拠を提供します。このアッセイの成功のための重要なコンポーネントは次のとおりです。哺乳動物細胞におけるPRMTsの1の発現、精製PRMTs 0002活性、基質の3発現および精製、ニトロセルロース膜へのタ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、RWへの退役軍人の米国エネルギー省、およびNIHのグラントR01CA138528から優秀賞によってサポートされていました。
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine | Perkin Elmer | ||
| Ecoscint ultra | National Diagnostics | LS-270 | |
| Bottle top dispenser | National Diagnostics | LS-900 | |
| AutoFluor | National Diagnostics | LS-315 | |
| 6 ml Scintillation Vials | National Diagnostics | SKU:SVC-06 | |
| GST-sepharose | GE Life Sciences | ||
| L-Glutathione Reduced | Sigma | G4251 | |
| Lipofectamine | Invitrogen | Transfection reagent | |
| Beas2B | ATCC | ||
| Optimem | Invitrogen | ||
| NP-40 | US-Biologicals | ||
| SDS | Sigma | ||
| Sodium deoxycholate | Sigma | ||
| PMSF | Sigma | ||
| anti-HA affinity matrix | Roche | ||
| Tris | Sigma | ||
| Nacl | Sigma | ||
| Bio-rad gel doc | Bio Rad | ||
| anti-HA antibody | roche | ||
| Ponseau S | Fisher Scientific |
Referências
- Paik, W. K., Kim, S. Protein methylase I. Purification and properties of the enzyme. J Biol Chem. 243, 2108-2114 (1968).
- Lin, W. J., Gary, J. D., Yang, M. C., Clarke, S., Herschman, H. R. The mammalian immediate-early TIS21 protein and the leukemia-associated BTG1 protein interact with a protein-arginine N-methyltransferase. J Biol Chem. 271, 15034-15044 (1996).
- Boffa, L. C., Karn, J., Vidali, G., Allfrey, V. G. Distribution of NG, NG,-dimethylarginine in nuclear protein fractions. Biochem Biophys Res Commun. 74, 969-976 (1977).
- Bedford, M. T. Arginine methylation at a glance. J Cell Sci. 120, 4243-4246 (2007).
- Lee, Y. H., Stallcup, M. R. Minireview: protein arginine methylation of nonhistone proteins in transcriptional regulation. Mol Endocrinol. 23, 425-433 (2009).
- Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Mol Cell. 33, 1-13 (2009).
- Bikkavilli, R. K., et al. Dishevelled3 is a novel arginine methyl transferase substrate. Scientific reports. 2, 805 (2012).
- Bikkavilli, R. K., Malbon, C. C. Arginine methylation of G3BP1 in response to Wnt3a regulates {beta}-catenin mRNA. J Cell Sci. 124, 2310-2320 (2011).
- Bikkavilli, R. K., Malbon, C. C. Wnt3a-stimulated LRP6 phosphorylation is dependent upon arginine methylation of G3BP2. J Cell Sci. , (2012).
- Tini, M., Naeem, H., Torchia, J. Biochemical analysis of arginine methylation in transcription. Methods Mol Biol. 523, 235-247 (2009).
- Lee, J., Cheng, D., Bedford, M. T. Techniques in protein methylation. Methods Mol Biol. 284, 195-208 (2004).
- Cheng, D., Vemulapalli, V., Bedford, M. T. Methods applied to the study of protein arginine methylation. Methods Enzymol. 512, 71-92 (2012).
- Zurita-Lopez, C. I., Sandberg, T., Kelly, R., Clarke, S. G. Human protein arginine methyltransferase 7 (PRMT7) is a type III enzyme forming omega-NG-monomethylated arginine residues. J Biol Chem. 287, 7859-7870 (2012).
