A metilação in vitro Ensaio de Proteína Estudo Arginina metilação
Summary
Proteína arginina metilação, catalisada por uma classe de enzimas viz., Proteína arginina metil transferases (PRMTs), é o processo de adição enzimática do grupo (s) metilo para argininas dentro proteínas. O ensaio de metilação in vitro é a ferramenta mais confiável para avaliar o estado de metilação de substratos PRMT conhecidos ou novos.
Abstract
Proteína arginina metilação é uma das modificações pós-traducionais mais abundantes no núcleo. Proteína arginina metilação pode ser identificada e / ou determinada por meio de métodos de proteómica, e / ou imunotransferência com anticorpos específicos metil-arginina. No entanto, essas técnicas às vezes pode ser enganosa e muitas vezes fornecem resultados falsos positivos. Mais importante, estas técnicas não podem constituir uma prova directa de apoio à especificidade do substrato PRMT. Ensaios in vitro de metilação, por outro lado, são os ensaios bioquímicos, que são sensíveis, e consistentemente se revelar as proteínas identificadas são realmente substratos PRMT. Um ensaio típico de metilação in vitro inclui, PRMTs activa purificada, purificada e substrato marcado com um radioisótopo doador de metilo (S-adenosil-L-[metil-3H] metionina). Aqui, descrevemos um protocolo passo-a-passo para isolar PRMT1 cataliticamente activo, um membro da família PRMT ubiquamente expressa. A mimtilo transferase da PRMT1 purificados foram depois testados em proteína Ras-activação da GTPase de ligação da proteína 1 (G3BP1), um substrato PRMT conhecido, na presença de S-adenosil-L-[metil-3H] metionina como o doador de metilo. Este protocolo pode ser utilizado não só para o estabelecimento do estado de metilação de novos substratos PRMT1 fisiológicos, mas também para a compreensão do mecanismo de base de arginina proteína metilação.
Introduction
Metilação proteína foi descrita pela primeira vez em 1968 1. Foi só a primeira clonagem de PRMT1 em 1996, que os pesquisadores começaram a apreciar a importância desta modificação pós-tradução 2. Curiosamente, cerca de 2% de resíduos de arginina em proteínas de extractos nucleares são metilados 3, indicando que a abundância desta modificação. A arginina é um aminoácido carregado positivamente, com uma cadeia lateral básica e os de azoto / s nas cadeias laterais de arginina pode ser modificada após a tradução através da adição de um grupo metilo, um processo conhecido como arginina metilação 4-6. Metilação arginina é catalisada por uma classe de enzimas viz. Transferases de proteína de metilo, arginina (PRMTs). Argininas pode ser ou dimetilado monomethylated e este último pode ser simétrica ou assimétrica, dependendo do tipo de PRMTs que catalisam o processo de 4-6.
Proteínas que mostrar argininae-glicina motivos ricos são alvos potenciais para a catálise mediada por PRMT. Metilação mediada por PRMT de substratos foi mostrado para modular a interacção proteína-proteína, interacção proteína-ácido nucleico, a função da proteína, a expressão do gene, e / ou de sinalização celular, as quais são essenciais para a homeostase celular normal 7-9. A fim de entender o papel biológico da proteína arginina metilação, ensaios precisos, eficientes e reproduzíveis são necessários para estabelecer o estado de metilação dos substratos PRMT identificados.
No ensaio in vitro de metilação, que avalia a capacidade de catalisar a PRMTs purificados metilação dos seus substratos, é um ensaio bem aceite para o estudo de metilação arginina 10-12. O êxito geral deste ensaio depende em grande parte da actividade dos PRMTs purificadas. PRMTs pode ser expressa e purificada a partir de bactérias ou células de mamífero 10,11. Este ensaio in vitro de metilação, como dPORMENORIZADA na secção de protocolo, baseia-se num método originalmente descrito por Tini e colegas 10. Neste protocolo, que mostram em detalhe os passos envolvidos na expressão e purificação da PRMT1 em células de mamíferos. A capacidade da PRMT1 purificada catalisar a metilação em Ras-activação da GTPase da proteína de ligação da proteína 1 (G3BP1), um substrato conhecido PRMT 8, foi depois avaliado na presença de S-adenosil-L-[metil-3H] metionina como o doador de metilo. Utilizando este ensaio, pode-se definir de forma fiável a capacidade dos PRMTs a novel metilato ou substratos conhecidos, o que é um passo fundamental no estudo da proteína arginina metilação.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo aqui descrito, é rotineiramente utilizada para estabelecer o estado de metilação dos substratos PRMT identificados. Este ensaio robusto e consistente também irá fornecer provas definitivas sobre a especificidade da PRMTs para os seus substratos. Os componentes essenciais para o sucesso deste ensaio são os seguintes: 1 Expressão de PRMTs em células de mamíferos, 2 Actividade de PRMTs purificadas, 3 Expressão e purificação de substrato, e 4 completa transferência western das proteínas para a memb…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado por um Prémio de Mérito do Departamento de Assuntos de Veteranos dos Estados Unidos, e um NIH conceder R01CA138528 a RW.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine | Perkin Elmer | ||
| Ecoscint ultra | National Diagnostics | LS-270 | |
| Bottle top dispenser | National Diagnostics | LS-900 | |
| AutoFluor | National Diagnostics | LS-315 | |
| 6 ml Scintillation Vials | National Diagnostics | SKU:SVC-06 | |
| GST-sepharose | GE Life Sciences | ||
| L-Glutathione Reduced | Sigma | G4251 | |
| Lipofectamine | Invitrogen | Transfection reagent | |
| Beas2B | ATCC | ||
| Optimem | Invitrogen | ||
| NP-40 | US-Biologicals | ||
| SDS | Sigma | ||
| Sodium deoxycholate | Sigma | ||
| PMSF | Sigma | ||
| anti-HA affinity matrix | Roche | ||
| Tris | Sigma | ||
| Nacl | Sigma | ||
| Bio-rad gel doc | Bio Rad | ||
| anti-HA antibody | roche | ||
| Ponseau S | Fisher Scientific |
Referências
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