In vitro Metylering analys för att studera protein Arginin Metylering
Summary
Protein arginin metylering, katalyserad av en klass av enzymer viz. Protein arginin metyl transferaser (PRMTs), är processen av enzymatisk tillsättning av metylgrupp (er) till argininer inom proteiner. In vitro-metylering analysen är den mest pålitliga verktyg för att bedöma metyleringsstatus av kända eller nya PRMT substrat.
Abstract
Protein arginin-metylering är en av de vanligast förekommande posttranslationella modifieringar i kärnan. Protein arginin metylering kan identifieras och / eller bestäms via proteomik metoder, och / eller immun med metyl-arginin specifika antikroppar. Men dessa tekniker kan ibland vara vilseledande och ger ofta falskt positiva resultat. Viktigast kan dessa tekniker inte ger direkta bevis till stöd för PRMT substratspecificiteten. In vitro metylering analyser, å andra sidan, är användbara biokemiska analyser, som är känsliga, och konsekvent avslöja om de identifierade proteinerna är verkligen PRMT substrat. En typisk in vitro-metylering analys innefattar renade, aktiva PRMTs, renade substratet och en radioisotop märkt metyl donator (S-adenosyl-L-[metyl-3H] metionin). Här beskriver vi en steg-för-steg-protokoll för att isolera katalytiskt aktiva PRMT1, en ubiquitously uttryckt PRMT familjemedlem. Den methyl transferas verksamhet renade PRMT1 senare testades på Ras-GTPas aktiverande protein bindande protein 1 (G3BP1), en känd PRMT substrat, i närvaro av S-adenosyl-L [metyl-3H] metionin som metyldonator. Detta protokoll kan användas inte bara för att fastställa metyleringsstatus av nya fysiologiska PRMT1 substrat, utan också för att förstå den grundläggande mekanismen av protein arginin metylering.
Introduction
Protein metylering beskrevs första gången 1968 1. Det var inte förrän den första kloning av PRMT1 1996, att forskare började inse betydelsen av denna post-translationell modifiering 2. Intressant är cirka 2% av argininrester i proteinerna i kärnextrakt metylerade 3, vilket indikerar överflödet av denna ändring. Arginin är en positivt laddad aminosyra med en basisk sidokedja och kväve / s inom sidokedjorna av arginin kan vara post-translationellt modifierat genom tillsats av en metylgrupp, en process som kallas arginin metylering 4-6. Arginin metylering katalyseras av en klass av enzymer nämligen., Protein arginin metyl transferaser (PRMTs). Argininer kan antingen monometylerad eller dimetylerad och den senare kan vara antingen symmetrisk eller asymmetrisk beroende på typen av PRMTs katalysera process 4-6.
Proteiner som visar arginine-glycin rika motiv är potentiella mål för PRMT-medierad katalys. PRMT medierad metylering av substrat har visats modulera protein-proteininteraktion, protein-nukleinsyra-interaktion, proteinfunktion, genuttryck och / eller cellulär signalering, som alla är kritiska för normal cellulär homeostas 7-9. För att förstå den biologiska betydelsen av protein arginin metylering är precisa, effektiva och reproducerbara analyser som krävs för att fastställa metyleringsstatus av de identifierade PRMT substrat.
I metylering vitro, som utvärderar förmågan hos renade PRMTs att katalysera metylering av sina substrat, är en väl accepterad analys för att studera arginin metylering 10-12. Den totala framgången för denna analys beror till stor del på aktiviteten hos de renade PRMTs. PRMTs kan uttryckas och renas från bakterier eller däggdjursceller 10,11. Denna metylering analys in vitro, som dETALJERAD i protokoll sektion, är baserat på en metod som ursprungligen beskrivits av Tini och kollegor 10. I detta protokoll, visar vi i detalj de steg som ingår i uttrycket och reningen av PRMT1 i däggdjursceller. Förmågan hos det renade PRMT1 att katalysera metylering på Ras-GTPas-aktiverande protein-bindande protein 1 (G3BP1), en känd PRMT substratet 8, var senare utvärderades i närvaro av S-adenosyl-L-[metyl-3H] metionin såsom den metyl donator. Med hjälp av denna analys, kan vi på ett tillförlitligt sätt definiera förmågor PRMTs till metylat roman eller kända substrat, vilket är ett primärt steg i studiet av protein arginin metylering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet som beskrivs häri används rutinmässigt för att fastställa metyleringsstatus av de identifierade PRMT substrat. Denna robusta, och konsekvent analys kommer också att ge definitiva bevis på specificitet PRMTs för deras substrat. De viktigaste komponenterna för att lyckas med denna analys är: 1 Redovisning av PRMTs i däggdjursceller, 2 Aktivitet av renade PRMTs, 3 Expression och rening av substrat, och 4 Komplett västra överföring av proteinerna till nitrocellulosamembranet.
<p class="jove_con…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av en Merit Award från US Department of Veterans Affairs, och en NIH bevilja R01CA138528 till RW.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine | Perkin Elmer | ||
| Ecoscint ultra | National Diagnostics | LS-270 | |
| Bottle top dispenser | National Diagnostics | LS-900 | |
| AutoFluor | National Diagnostics | LS-315 | |
| 6 ml Scintillation Vials | National Diagnostics | SKU:SVC-06 | |
| GST-sepharose | GE Life Sciences | ||
| L-Glutathione Reduced | Sigma | G4251 | |
| Lipofectamine | Invitrogen | Transfection reagent | |
| Beas2B | ATCC | ||
| Optimem | Invitrogen | ||
| NP-40 | US-Biologicals | ||
| SDS | Sigma | ||
| Sodium deoxycholate | Sigma | ||
| PMSF | Sigma | ||
| anti-HA affinity matrix | Roche | ||
| Tris | Sigma | ||
| Nacl | Sigma | ||
| Bio-rad gel doc | Bio Rad | ||
| anti-HA antibody | roche | ||
| Ponseau S | Fisher Scientific |
Referências
- Paik, W. K., Kim, S. Protein methylase I. Purification and properties of the enzyme. J Biol Chem. 243, 2108-2114 (1968).
- Lin, W. J., Gary, J. D., Yang, M. C., Clarke, S., Herschman, H. R. The mammalian immediate-early TIS21 protein and the leukemia-associated BTG1 protein interact with a protein-arginine N-methyltransferase. J Biol Chem. 271, 15034-15044 (1996).
- Boffa, L. C., Karn, J., Vidali, G., Allfrey, V. G. Distribution of NG, NG,-dimethylarginine in nuclear protein fractions. Biochem Biophys Res Commun. 74, 969-976 (1977).
- Bedford, M. T. Arginine methylation at a glance. J Cell Sci. 120, 4243-4246 (2007).
- Lee, Y. H., Stallcup, M. R. Minireview: protein arginine methylation of nonhistone proteins in transcriptional regulation. Mol Endocrinol. 23, 425-433 (2009).
- Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Mol Cell. 33, 1-13 (2009).
- Bikkavilli, R. K., et al. Dishevelled3 is a novel arginine methyl transferase substrate. Scientific reports. 2, 805 (2012).
- Bikkavilli, R. K., Malbon, C. C. Arginine methylation of G3BP1 in response to Wnt3a regulates {beta}-catenin mRNA. J Cell Sci. 124, 2310-2320 (2011).
- Bikkavilli, R. K., Malbon, C. C. Wnt3a-stimulated LRP6 phosphorylation is dependent upon arginine methylation of G3BP2. J Cell Sci. , (2012).
- Tini, M., Naeem, H., Torchia, J. Biochemical analysis of arginine methylation in transcription. Methods Mol Biol. 523, 235-247 (2009).
- Lee, J., Cheng, D., Bedford, M. T. Techniques in protein methylation. Methods Mol Biol. 284, 195-208 (2004).
- Cheng, D., Vemulapalli, V., Bedford, M. T. Methods applied to the study of protein arginine methylation. Methods Enzymol. 512, 71-92 (2012).
- Zurita-Lopez, C. I., Sandberg, T., Kelly, R., Clarke, S. G. Human protein arginine methyltransferase 7 (PRMT7) is a type III enzyme forming omega-NG-monomethylated arginine residues. J Biol Chem. 287, 7859-7870 (2012).
