In vitro Metilasyona Tahlil Protein Arginin metilasyon Okuyacak
Summary
Protein arginin metilasyonu, diğer bir deyişle, enzimler sınıfı tarafından katalizlenmektedir. Protein arjinin metil transferaz (PRMTs), proteinler içindeki arginines metil grup (lar) ilave enzimatik işlemidir. In vitro deney, metilasyon, bilinen veya yeni PRMT substratların metilasyon durumunu değerlendirmek için en güvenilir bir araçtır.
Abstract
Protein arginin metilasyon çekirdeğinde en bol post-translasyonel modifikasyonlar biridir. Protein arginin metilasyon tespit ve / veya proteomik yaklaşımlar ile belirlenir, ve / ya da metil-arginin özel antikorlar ile immunoblotting edilebilir. Ancak, bu teknikler bazen yanıltıcı olabilir ve sık sık yanlış pozitif sonuçlar vermektedir. En önemlisi, bu teknikler, metilasyon deneyler, diğer yandan, hassas olan yararlı biyokimyasal deneyler, in vitro olarak. PRMT substrat spesifikliği desteklemek için doğrudan bir kanıt sağlayamaz ve tanımlanan proteinlerin gerçekte PRMT alt-tabakalar ise sürekli olarak ortaya koymaktadır. Tipik olarak in vitro deney, metilasyon, saflaştırılmış aktif PRMTs saflaştırılmış alt-tabaka ve bir radyo-izotop işaretli metil donörü (S-adenosil-L-[metil-3H] metionin) içerir. Burada katalitik olarak aktif PRMT1 bir yerde ifade PRMT aile üyesi izole edilmesi için bir adım adım protokol açıklar. BeniSaflaştırılmış PRMT1 arasında methyl transferaz aktiviteleri daha sonra S-adenosil-L-metil donörü [metil-3H] Metioninin varlığında, protein 1 (G3BP1) bağlayıcı bir Ras-GTPaz aktive edici protein, bilinen bir PRMT alt-tabaka test edilmiştir. Bu protokol, yeni fizyolojik PRMT1 substratların metilasyon durumunu oluşturulması için değil, aynı zamanda protein arginin metilasyon temel mekanizmasını anlamak için sadece kullanılabilecektir.
Introduction
Protein metilasyonu ilk kez 1968 1 yılında tanımlanmıştır. Araştırmacılar 2 Bu post-translasyonel modifikasyon önemini takdir başladı, 1996 yılında PRMT1 ilk klonlanması kadar değildi. İlginç bir şekilde, nükleer özler proteinlerinin arginin kalıntısının yaklaşık% 2, bu değişiklik gösteren bolluğu, 3, metile edilir. Arginin olabilir arginin yan zincirleri içinde bir bazik yan zincire ve nitrojen / s olan, pozitif yüklü bir amino asit olup, çeviri sonrası bir metil grubu, arginin metilasyon 4-6 olarak bilinen bir süreç eklenmesi ile değiştirilmiş. Arginin metilasyon enzim yani bir sınıf ile katalize edilmektedir. Protein arjinin metil transferaz (PRMTs). Mono-ya da dimetile arjinin ve ikincisi işlemi 4-6 katalize PRMTs türüne bağlı olarak simetrik veya asimetrik olabilir halinde olabilir.
Arginin gösterilecek ProteinlerE-glisin bakımından zengin motifleri PRMT aracılığıyla meydana gelen katalizler için potansiyel hedeflerdir. Substratların PRMT aracılı metilasyon normal hücresel homeostaz 7-9 için çok önemli olan, her biri, protein-protein etkileşimi, protein-nükleik asit etkileşimi, proteinin, fonksiyon, gen ekspresyonunu, ve / veya hücresel sinyal modüle ettiği gösterilmiştir. Protein arginin metilasyon biyolojik rolünü anlamak için, kesin etkili ve yeniden üretilebilir bir deneyler tespit PRMT substratların metilasyon durumunu oluşturmak için gereklidir.
Substratlannın metilasyonunu katalize etmek üzere saflaştırılmıştır PRMTs yeteneklerini değerlendirir nitro metilasyon tahlilinde, arginin, metilasyon 10-12 araştırılması için kabul edilen bir testtir. Bu deneyin genel başarısı büyük oranda saflaştırılmış PRMTs aktivitesine bağlıdır. PRMTs ifade bakteri ya da memeli hücrelerinden 10,11 saflaştırılabilir. D Bu in vitro deney, metilasyon,Protokol bölümünde etailed, orjinal Tini ve arkadaşları 10 tarafından tarif edilen bir yönteme dayanmaktadır. Bu protokol, detaylı olarak, memeli hücrelerinde PRMT1 ekspresyonu ve saflaştırılması yer alan adımları göstermektedir. Protein bağlayıcı protein 1 (G3BP1), bilinen PRMT alt-tabaka 8, ras-GTPaz aktive edici ile metilasyonu katalizleme saflaştırılmış PRMT1 kabiliyeti daha olarak S-adenosil-L-[metil-3H] Metioninin varlığında değerlendirildi metil donör. Bu analizi kullanarak, güvenilir bir şekilde bir protein arginin metilasyon çalışmada temel bir adımdır metilat roman ya da bilinen alt-tabakalar için, PRMTs yeteneklerini tanımlayabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada tarif edilen protokol rutin olarak tespit PRMT substratların metilasyon durumunu belirlemek için kullanılır. Bu sağlam ve tutarlı bir tahlil de kendi alt tabakalar için PRMTs spesifıtesine kesin kanıt sağlayacaktır. Bu deneyde başarısı için anahtar bileşenleri şunlardır: Memeli hücrelerinde PRMTs 1. ekspresyonu arıtılmış PRMTs 2. Aktivite, 3. ekspresyonu ve alt-tabaka saflaştırılması ve nitroselüloz zara 4. Tam proteinlerin western transfer.
Rekombinant ifa…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Gazi İşleri US Department Merit Ödülü tarafından desteklenen ve bir NIH RW için R01CA138528 hibe edildi.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine | Perkin Elmer | ||
| Ecoscint ultra | National Diagnostics | LS-270 | |
| Bottle top dispenser | National Diagnostics | LS-900 | |
| AutoFluor | National Diagnostics | LS-315 | |
| 6 ml Scintillation Vials | National Diagnostics | SKU:SVC-06 | |
| GST-sepharose | GE Life Sciences | ||
| L-Glutathione Reduced | Sigma | G4251 | |
| Lipofectamine | Invitrogen | Transfection reagent | |
| Beas2B | ATCC | ||
| Optimem | Invitrogen | ||
| NP-40 | US-Biologicals | ||
| SDS | Sigma | ||
| Sodium deoxycholate | Sigma | ||
| PMSF | Sigma | ||
| anti-HA affinity matrix | Roche | ||
| Tris | Sigma | ||
| Nacl | Sigma | ||
| Bio-rad gel doc | Bio Rad | ||
| anti-HA antibody | roche | ||
| Ponseau S | Fisher Scientific |
Referências
- Paik, W. K., Kim, S. Protein methylase I. Purification and properties of the enzyme. J Biol Chem. 243, 2108-2114 (1968).
- Lin, W. J., Gary, J. D., Yang, M. C., Clarke, S., Herschman, H. R. The mammalian immediate-early TIS21 protein and the leukemia-associated BTG1 protein interact with a protein-arginine N-methyltransferase. J Biol Chem. 271, 15034-15044 (1996).
- Boffa, L. C., Karn, J., Vidali, G., Allfrey, V. G. Distribution of NG, NG,-dimethylarginine in nuclear protein fractions. Biochem Biophys Res Commun. 74, 969-976 (1977).
- Bedford, M. T. Arginine methylation at a glance. J Cell Sci. 120, 4243-4246 (2007).
- Lee, Y. H., Stallcup, M. R. Minireview: protein arginine methylation of nonhistone proteins in transcriptional regulation. Mol Endocrinol. 23, 425-433 (2009).
- Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Mol Cell. 33, 1-13 (2009).
- Bikkavilli, R. K., et al. Dishevelled3 is a novel arginine methyl transferase substrate. Scientific reports. 2, 805 (2012).
- Bikkavilli, R. K., Malbon, C. C. Arginine methylation of G3BP1 in response to Wnt3a regulates {beta}-catenin mRNA. J Cell Sci. 124, 2310-2320 (2011).
- Bikkavilli, R. K., Malbon, C. C. Wnt3a-stimulated LRP6 phosphorylation is dependent upon arginine methylation of G3BP2. J Cell Sci. , (2012).
- Tini, M., Naeem, H., Torchia, J. Biochemical analysis of arginine methylation in transcription. Methods Mol Biol. 523, 235-247 (2009).
- Lee, J., Cheng, D., Bedford, M. T. Techniques in protein methylation. Methods Mol Biol. 284, 195-208 (2004).
- Cheng, D., Vemulapalli, V., Bedford, M. T. Methods applied to the study of protein arginine methylation. Methods Enzymol. 512, 71-92 (2012).
- Zurita-Lopez, C. I., Sandberg, T., Kelly, R., Clarke, S. G. Human protein arginine methyltransferase 7 (PRMT7) is a type III enzyme forming omega-NG-monomethylated arginine residues. J Biol Chem. 287, 7859-7870 (2012).
