In vitro metilación de ensayo para estudiar la proteína arginina metilación
Summary
Proteína arginina metilación, catalizada por una clase de enzimas viz., La proteína arginina metil transferasas (PRMTs), es el proceso de adición enzimática de grupo (s) metilo para argininas dentro de las proteínas. El ensayo de metilación in vitro es la herramienta más fiable para evaluar el estado de metilación de sustratos PRMT conocidos o nuevos.
Abstract
Proteína arginina metilación es una de las más abundantes modificaciones post-traduccionales en el núcleo. Proteína arginina metilación se puede identificar y / o determina a través de enfoques proteómicos, y / o inmunotransferencia con anticuerpos específicos metil-arginina. Sin embargo, estas técnicas a veces pueden ser engañosas ya menudo proporcionan resultados positivos falsos. Más importante, estas técnicas no pueden proporcionar evidencia directa en apoyo de la especificidad de sustrato PRMT. Los ensayos in vitro de metilación, por otro lado, son ensayos bioquímicos útiles, que son sensibles, y consistentemente revelan si las proteínas identificadas son de hecho los sustratos PRMT. Un ensayo típico de metilación in vitro incluye, PRMTs activos purificados, sustrato purificado y marcado con un radioisótopo metil donante (S-adenosil-L-[metil-3H] metionina). Aquí se describe un protocolo de paso a paso para aislar PRMT1 catalíticamente activo, un miembro de la familia PRMT doquier expresó. El metransferasa actividades Thyl del PRMT1 purificada más tarde fueron probados en Ras-proteína activadora de GTPasa proteína de unión 1 (G3BP1), un sustrato PRMT conocido, en presencia de S-adenosil-L-[metil-3H] metionina como donante de metilo. Este protocolo se puede emplear no sólo para establecer el estado de metilación de sustratos fisiológicos PRMT1 nuevos, sino también para la comprensión del mecanismo básico de la metilación de arginina de proteínas.
Introduction
Metilación de proteínas fue descrita por primera vez en 1968 1. No fue sino hasta la primera clonación de PRMT1 en 1996, que los investigadores comenzaron a apreciar la importancia de esta modificación después de la traducción 2. Curiosamente, alrededor del 2% de los residuos de arginina en las proteínas de extractos nucleares se metilado 3, lo que indica la abundancia de esta modificación. La arginina es un aminoácido cargado positivamente con una cadena lateral básica y el nitrógeno / s dentro de las cadenas laterales de arginina puede ser modificado después de la traducción a través de la adición de un grupo metilo, un proceso conocido como arginina metilación 4-6. Metilación de arginina es catalizada por una clase de enzimas viz., Transferasas proteína arginina metil (PRMTs). Argininas pueden o bien ser monometilado o dimetilado y el segundo pueden ser simétricos o asimétricos, dependiendo del tipo de PRMTs que catalizan el proceso de 4-6.
Las proteínas que muestran argininamotivos ricos e-glicina son objetivos potenciales para la catálisis PRMT mediada. PRMT metilación mediada de sustratos se ha demostrado que modulan la interacción proteína-proteína, interacciones proteína-ácido nucleico, la función de proteínas, la expresión génica, y / o de señalización celular, todos los cuales son críticos para la homeostasis celular normal 7-9. Con el fin de entender el papel biológico de la proteína metilación de arginina, se requieren ensayos precisos, eficientes y reproducibles para establecer el estado de metilación de los sustratos PRMT identificados.
En ensayo de metilación in vitro, que evalúa las capacidades de PRMTs purificadas para catalizar la metilación de sus sustratos, es un ensayo bien aceptado para el estudio de la metilación de arginina 10-12. El éxito general de este ensayo depende en gran medida de la actividad de los PRMTs purificados. PRMTs pueden ser expresadas y purificadas a partir de bacterias o células de mamífero, 10,11. Este ensayo de metilación in vitro, como detailed en la sección de protocolo, se basa en un método descrito originalmente por Tini y sus colegas 10. En este protocolo, se muestra en detalle los pasos necesarios para la expresión y purificación de PRMT1 en células de mamíferos. La capacidad de la PRMT1 purificada para catalizar la metilación en Ras GTPasa-activación de la proteína de unión a la proteína 1 (G3BP1), un sustrato conocido PRMT 8, más tarde fue evaluada en presencia de S-adenosil-L-[metil-3H] metionina como el donante de metilo. Utilizando este ensayo, podemos definir con fiabilidad las habilidades de los PRMTs a la novela metilato o sustratos conocidos, que es un paso principal en el estudio de la metilación de arginina de proteínas.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito en el presente documento se utiliza rutinariamente para establecer el estado de metilación de los sustratos PRMT identificados. Este ensayo robusto y consistente también proporcionará evidencia definitiva de la especificidad de PRMTs para sus sustratos. Los componentes clave para el éxito de este ensayo son: 1. Expresión de PRMTs en células de mamífero, 2. Actividad de PRMTs purificados, 3. Expresión y purificación de sustrato, y 4. transferencia Western completa de las proteínas a la mem…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por un Premio al Mérito del Departamento de Asuntos de Veteranos de Estados Unidos, y un NIH conceder R01CA138528 a RW.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine | Perkin Elmer | ||
| Ecoscint ultra | National Diagnostics | LS-270 | |
| Bottle top dispenser | National Diagnostics | LS-900 | |
| AutoFluor | National Diagnostics | LS-315 | |
| 6 ml Scintillation Vials | National Diagnostics | SKU:SVC-06 | |
| GST-sepharose | GE Life Sciences | ||
| L-Glutathione Reduced | Sigma | G4251 | |
| Lipofectamine | Invitrogen | Transfection reagent | |
| Beas2B | ATCC | ||
| Optimem | Invitrogen | ||
| NP-40 | US-Biologicals | ||
| SDS | Sigma | ||
| Sodium deoxycholate | Sigma | ||
| PMSF | Sigma | ||
| anti-HA affinity matrix | Roche | ||
| Tris | Sigma | ||
| Nacl | Sigma | ||
| Bio-rad gel doc | Bio Rad | ||
| anti-HA antibody | roche | ||
| Ponseau S | Fisher Scientific |
Referências
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