In vitro Metylering analysen å studere Protein Arginin Metylering

Summary

Protein arginin metylering, katalysert av en klasse av enzymer viz. Protein arginin metyl transferaser (PRMTs), prosessen for enzymatisk tilsetning av metyl-gruppen (e) til arginines innenfor proteiner. Den in vitro-metylering analysen er den mest pålitelige verktøy for å bedømme status for metylering kjente eller nye PRMT substrater.

Abstract

Protein arginin metylering er en av de mest tallrike posttranslasjonelle modifikasjoner i kjernen. Protein arginin metylering kan identifiseres og / eller bestemmes via proteomic nærmer seg, og / eller immunoblotting med metyl-arginin-spesifikke antistoffer. Imidlertid er disse teknikker kan noen ganger være misvisende og gir ofte falske positive resultater. Viktigst, kan disse teknikkene ikke gir direkte bevis til støtte for PRMT substratspesifisitet. In vitro assays metylering, på den annen side, er nyttige biokjemiske analyser, som er følsom, og konsekvent avdekke om de identifiserte proteiner er faktisk PRMT substrater. Et typisk in vitro-analysen omfatter metylering rensede, aktive PRMTs, renset substrat og en radioisotop-merket metyl donor ^{(S-adenosyl-L-[metyl-3H]} metionin). Her beskriver vi en steg-for-steg-protokollen for å isolere katalytisk aktivt PRMT1, en ubiquitously uttrykt PRMT familiemedlem. Den megmetyl- transferase aktivitet av det rensede PRMT1 ble senere testet på Ras-GTPase aktiverende protein-bindende protein 1 (G3BP1), en kjent PRMT substrat, i nærvær av ^{S-adenosyl-L-[metyl-3H]} metionin som metyl donor. Denne protokollen kan bli benyttet ikke bare for å etablere en status metylering av nye fysiologiske PRMT1 substrater, men også for å forstå den grunnleggende mekanisme for protein arginin metylering.

Introduction

Protein metylering ble først beskrevet i 1968. ^1. Det var ikke før den første kloning av PRMT1 i 1996, at forskere begynte å forstå viktigheten av denne post-translasjonell modifikasjon ^to. Interessant nok er omtrent 2% av arginin rester i proteiner av nukleære ekstrakter metylert ^3, som indikerer at overflod av denne modifikasjon. Arginin er en positivt ladet aminosyre med en sidekjede, og grunnleggende nitrogen / s i løpet av sidekjedene av arginin kan være post-translasjonelt modifisert gjennom tilsetning av en metylgruppe, en prosess kjent som arginin metylering ^4-6. Arginin metylering er katalysert av en klasse av enzymer viz. Protein, arginin metyl-transferaser (PRMTs). Arginines kan enten monomethylated eller dimethylated og sistnevnte kan være enten symmetrisk eller asymmetrisk alt etter den type PRMTs katalyserende prosess ^4-6.

Proteiner som viser Arginine-glysin rike motiver er potensielle mål for PRMT-mediert katalyse. PRMT-mediert metylering av substrater er vist å modulere protein-protein interaksjon, protein-nukleinsyre interaksjon, proteinfunksjon, genekspresjon og / eller cellulær signalisering, som alle er kritisk for normal cellulær homeostase ^7-9. For å forstå den biologiske rolle av protein arginin metylering, er nøyaktig, effektiv og reproduserbar analyser som kreves for å etablere den metylering status for de identifiserte PRMT substrater.

In vitro-assay metylering, som evaluerer evnene rensede PRMTs å katalysere metylering av deres substrater, er en godt akseptert test for å studere arginin metylering ^10-12. Den generelle suksess for denne analysen avhenger i stor grad aktiviteten av de rensede PRMTs. PRMTs kan bli uttrykt og renset fra bakterier, pattedyrceller eller ^10,11. Denne in vitro-assay metylering, som detailed i protokollen delen, er basert på en metode som opprinnelig ble beskrevet av Tini og kolleger ^10. I denne protokollen, viser vi i detalj trinnene involvert i uttrykket og rensing av PRMT1 i pattedyrceller. Evnen til rensede PRMT1 å katalysere metylering på Ras-GTPase aktiverende protein-bindende protein 1 (G3BP1), en kjent PRMT substrat ^8, ble senere undersøkt i nærvær av ^{S-adenosyl-L-[metyl-3H]} metionin som den metyl donor. Ved hjelp av dette assay, kan vi definere pålitelig evnene til PRMTs til metylat nye eller kjente substrater, som er et primært trinn i studiet av protein arginin metylering.

Protocol

1. Utarbeidelse av ekspresjonskonstruksjoner Før start av protokollen, klone PRMTs i mammalske ekspresjonsvektorer med en N-terminal epitop tag (Myc eller HA), og substratet i-ramme med glutation-S-transferase (GST) for high-level protein ekspresjon og rensing av bakterielt celle lysater, ved hjelp av standard molekylærbiologiske teknikker. 2. Rensing av PRMTs Bruk 100 mm kultur retter å opprettholde menneske bronkial epitelceller (Beas2B). Passage cellene hver…

Representative Results

Evnene til HA-PRMT1 å metilat GST-G3BP1 ble bestemt av en in vitro metylering analysen. HA-merket PRMT1 renset fra Beas2B cellelysater ble anvendt i en reaksjon inneholdende GST metylering-G3BP1, og 1 uCi av S-adenosyl-L-[metyl-3H] metionin, som en metyl-donor. PRMT1 kunne effektivt katalysere metylering av GST-G3BP1 (Figur 1, øvre panel). Metylering reaksjoner ved bruk av rullegardin utført på lysates av tom vektor transfekterte Beas2B celler fungerte som en negativ kontro…

Discussion

Den protokoll som er beskrevet her brukes rutinemessig for å etablere den metylering status for de identifiserte PRMT substrater. Denne robuste, og konsekvent analysen vil også gi definitive bevis på det spesielle ved PRMTs for sine underlag. De viktigste komponenter for suksess for denne analysen er: 1. Ekspresjon av PRMTs i pattedyrceller, 2. Aktivitet av rensede PRMTs, 3. Ekspresjon og rensing av substrat, og 4. Fullstendig western overføring av proteinene til nitrocellulose-membran.

…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine	Perkin Elmer
Ecoscint ultra	National Diagnostics	LS-270
Bottle top dispenser	National Diagnostics	LS-900
AutoFluor	National Diagnostics	LS-315
6 ml Scintillation Vials	National Diagnostics	SKU:SVC-06
GST-sepharose	GE Life Sciences
L-Glutathione Reduced	Sigma	G4251
Lipofectamine	Invitrogen		Transfection reagent
Beas2B	ATCC
Optimem	Invitrogen
NP-40	US-Biologicals
SDS	Sigma
Sodium deoxycholate	Sigma
PMSF	Sigma
anti-HA affinity matrix	Roche
Tris	Sigma
Nacl	Sigma
Bio-rad gel doc	Bio Rad
anti-HA antibody	roche
Ponseau S	Fisher Scientific