軟寒天コロニー形成アッセイ
Summary
The soft agar colony formation assay is a method used to confirm cellular anchorage-independent growth in vitro. The goal of this protocol is to illustrate a stringent method for the detection of the tumorigenic potential of transformed cells and the tumor suppressive effects of proteins on transformed cells.
Abstract
Anchorage-independent growth is the ability of transformed cells to grow independently of a solid surface, and is a hallmark of carcinogenesis. The soft agar colony formation assay is a well-established method for characterizing this capability in vitro and is considered to be one of the most stringent tests for malignant transformation in cells. This assay also allows for semi-quantitative evaluation of this capability in response to various treatment conditions. Here, we will demonstrate the soft agar colony formation assay using a murine lung carcinoma cell line, CMT167, to demonstrate the tumor suppressive effects of two members of the Wnt signaling pathway, Wnt7A and Frizzled-9 (Fzd-9). Concurrent overexpression of Wnt7a and Fzd-9 caused an inhibition of colony formation in CMT167 cells. This shows that expression of Wnt7a ligand and its Frizzled-9 receptor is sufficient to suppress tumor growth in a murine lung carcinoma model.
Introduction
軟寒天コロニー形成アッセイは、広く、インビトロで細胞形質転換を評価するために使用される技術である。歴史的に、別のアッセイは、パックらによって記載され 1956年にクローン原性アッセイは、コロニー1を形成する細胞の能力を評価するために使用した。この技術では、細胞を培養プレート上に分散させ、必要な成長因子を提供するための「フィーダー」細胞または馴化培地の存在下で増殖させた。この技術の制限は、それが唯一のコロニー形成に関する情報を提供したことであった。正常細胞は、アノイキス2と呼ばれるアポトーシス死の特定のタイプに、足場非依存性増殖を防止することができる。しかし、形質転換細胞は、基質に結合することなく成長し、分裂する能力を有する。この概念を活用するために、研究者らは軟寒天コロニー形成アッセイを開発しました。軟寒天コロニー形成アッセイは、以降のspに対応するために、より近年では、改変されているecificニーズ。一変形形態では、ハイスループットコロニー計数を可能にするために、蛍光色素の取り込みを含む。別の変形例は、タンパク質またはDNAのサンプルが必要な場合にコロニーを形成した後の生存細胞の回収を可能にするために特殊な寒天溶液の使用を含む。
従来の軟寒天コロニー形成アッセイにおいて、細胞は、軟寒天の別の層上に載っている細胞培養培地を含む軟寒天混合物の層で増殖される細胞培養培地と混合したが、寒天、より高い濃度で含有する。これは、培養プレートに付着する細胞を防ぎ、まだ目に見えるコロニーを形成する細胞を形質転換することを可能にする。この手法の背後にある理論的根拠は、正常細胞が成長し、分裂することができるように、細胞外マトリックスへの細胞接触に依存することである。逆に、形質転換された細胞は成長し、関係なく周囲の環境の分裂能を有している。したがって、足場非依存性の方法でコロニーを形成することができる細胞は、cた形質転換されるonsideredと発がん性。この方法の全体的な目標は、半定量的かつ厳格な方法で、細胞内でこの機能を測定することである。
Wntシグナル伝達経路は、胚発生に重要な、しばしば腫瘍形成3-6で脱調節されている。 Wntシグナル伝達に関連する複数の経路がある。標準経路は、転写コアクチベータカテニンに対するその効果を通してWntシグナル伝達および下流の遺伝子転写の調節を必要とする。 Wntはまた、例えば、いくつかの非標準的な経路を介して細胞骨格構造7、および小胞体8からのカルシウムの放出を調節するのWnt-カルシウム経路に関与する要素を調節する平面細胞極性経路を、信号。 Wntシグナルリガンドが結合フリッツルド受容体を介してその活性を発揮する。いくつかのWntが肺癌において上方制御されることが示されているが、Wnt7a、非Smalの中でダウンレギュレートされることが示されているプロモーターのメチル化9を介してLの細胞肺癌。 Wnt7aはFZD9を結合し、非標準的経路を介して腫瘍抑制因子として機能します。のWnt-7aおよびFZD-9の回復は、非小細胞肺癌細胞10の成長を阻害する。 Wnt7a / FZD9の効果は、ERK-5、今度は、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（PPARγ）11,12を作動させるの活性化を介して媒介される。ここでは、Wnt7aおよびFZD9の過剰発現は、マウス肺癌細胞株の足場非依存性増殖の抑制をもたらすことを示している。マウスCMT167細胞はC57BL / lcrfマウス13で肺癌に由来しかつ安定Wnt7AおよびFZD9トランスフェクトした。 Wnt7AとFZD9の過剰発現は、定量的PCR（Q-PCR）によって確認したとWnt7AとFZD9過剰発現の機能は、PPARγの下流の活性化を介して確認された。
Protocol
Representative Results
Discussion
シグナル伝達タンパク質の腫瘍抑制機能のインビトロでの確認は困難である。このプロパティを調査するために利用できる最も厳格なアッセイの1つは、軟寒天コロニー形成アッセイである。ここでは、安定的にその親CMT167細胞株と比較して、Wnt7aおよびFZD9を過剰発現するマウス肺癌細胞株を用いて、軟寒天コロニー形成アッセイを例示している。
軟?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by a Merit Award from the U.S. Department of Veterans Affairs, and an NIH grant R01CA1385282522717 to RW.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Cancer Cell Line of Interest | Sigma-Aldrich | 10032302 | CMT-167 Cells |
| Powdered RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-089 | Used to prepare 2X cell culture medium. |
| Liquid RPMI 1650 Medium | Cellgro | 10-040-CV | Referred to as 1X cell culture medium. |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30910.03 | Used to supplement cell culture medium. |
| Penicillin/Streptomycin | CellGro | 30-002-Cl | Used in cell culture medium. |
| Difco Noble Agar | BD Biosciences | 214230 | Used to prepare 1.0% and 0.6% Agar. |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | BP-328-1 | Used in 2X cell culture medium. |
| Trypsin | Cellgro | 25-050-Cl | |
| Sterile Bottle-Top Filters | Fisher | 09-761-126 | Used to sterile filter 2X medium. |
| Lipofectamine Reagent | Invitrogen | 18324-020 | Used in PPAR-RE luciferase assay. |
| 6-well Plates Tissue-culture Treated | |||
| 37 degree C/5% CO2 Incubator | |||
| Chemi-Doc Imager | Bio-Rad | Used to take pictures of colonies. | |
| Quantity One Software | Bio-Rad | Used to count cell colonies. | |
| 15mL Conical Tubes | |||
| 50mL Conical Tubes | |||
| 250mL Erlenmeyer Flasks | |||
| Microwave | |||
| 5mL Serological Pipettes | |||
| Pipette Aid | |||
| Micropipette | |||
| Hemacytometer w/ cover slip | |||
| Pipette Tips | |||
| Inverted Light Microscope | |||
| Centrifuge | |||
| Heat-Resistant Gloves | |||
| Saran Wrap | |||
| Ice Bucket |
Referências
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