De Soft Agar Kolonie Formatie Assay
Summary
The soft agar colony formation assay is a method used to confirm cellular anchorage-independent growth in vitro. The goal of this protocol is to illustrate a stringent method for the detection of the tumorigenic potential of transformed cells and the tumor suppressive effects of proteins on transformed cells.
Abstract
Anchorage-independent growth is the ability of transformed cells to grow independently of a solid surface, and is a hallmark of carcinogenesis. The soft agar colony formation assay is a well-established method for characterizing this capability in vitro and is considered to be one of the most stringent tests for malignant transformation in cells. This assay also allows for semi-quantitative evaluation of this capability in response to various treatment conditions. Here, we will demonstrate the soft agar colony formation assay using a murine lung carcinoma cell line, CMT167, to demonstrate the tumor suppressive effects of two members of the Wnt signaling pathway, Wnt7A and Frizzled-9 (Fzd-9). Concurrent overexpression of Wnt7a and Fzd-9 caused an inhibition of colony formation in CMT167 cells. This shows that expression of Wnt7a ligand and its Frizzled-9 receptor is sufficient to suppress tumor growth in a murine lung carcinoma model.
Introduction
De zachte agar kolonievorming assay is een techniek veel gebruikt om cellulaire transformatie in vitro evalueren. Historisch andere test de clonogene assay beschreven door Puck et al. In 1956 werd gebruikt om het vermogen van cellen om kolonies te vormen 1 evalueren. In deze techniek werden cellen gedispergeerd op een kweekplaat en gekweekt in aanwezigheid van feeder-cellen of geconditioneerd medium noodzakelijke groeifactoren verschaffen. De beperking van deze techniek is dat het alleen informatie verstrekt over de vorming van kolonies. Normale cellen verhinderd verankering-onafhankelijke groei, door een bepaald type van apoptotische dood, genaamd anoikis 2. Echter, getransformeerde cellen hebben het vermogen om te groeien en delen zonder binding aan een substraat. Om te profiteren van dit concept, onderzoekers ontwikkelden de zachte agar kolonievorming assay. De zachte agar kolonieformatie assay is sindsdien gewijzigd, in meer recente jaren, te sp pakkenecifieke behoeften. Eén variatie omvat incorporatie van fluorometrische kleurstof om voor high-throughput kolonie tellen. Een andere variatie omvat het gebruik van gespecialiseerde agar oplossing om voor het ophalen van levensvatbare cellen na kolonievorming bij eiwit of DNA monsters nodig.
In de traditionele zachte agar kolonievorming assay worden cellen gekweekt in een laag zachte agar gemengd met celkweekmedium die rust op een laag zacht agar, ook gemengd met celkweekmedium, maar dat een hogere concentratie van agar. Dit voorkomt dat cellen van het naleven van de cultuur plaat, maar toch maakt getransformeerde cellen tot zichtbare kolonies vormen. De grondgedachte achter deze techniek is dat normale cellen afhankelijk cel extracellulaire matrix contact kunnen groeien en delen. Omgekeerd getransformeerde cellen kunnen groeien en verdeel ongeacht hun omgeving. Daarom cellen in staat zijn om kolonies te vormen in een verankering-onafhankelijke wijze werden considered te transformeren en carcinogeen. Het algemene doel van deze methode is deze mogelijkheid in cellen te meten in een semi-kwantitatief en strikte manier.
De Wnt signaleringsroute is van cruciaal belang in de embryogenese en vaak gedereguleerde in het ontstaan van tumoren 3-6. Er zijn meerdere routes in verband met Wnt-signalering. De canonieke weg omvat Wnt signalisatie en regulatie van de downstream-gen transcriptie door haar effecten op de transcriptionele coactivator beta-catenine. Wnts signaal ook door verscheidene nietcanonieke trajecten, bijvoorbeeld de planaire celpolariteit signaalweg die elementen voor het cytoskeletstructuur 7 regelt, en de Wnt-route calcium, wat afgifte van calcium reguleert van het endoplasmatisch reticulum 8. Wnt liganden oefenen hun activiteit uit door binding Frizzled receptoren. Hoewel verschillende Wnts is aangetoond opgereguleerd in longkanker, is Wnt7a aangetoond worden down-gereguleerd in niet-small cellige longkanker door promotor methylering 9. Wnt7a bindt Fzd9 en fungeert als een tumor suppressor via een niet-canonieke route. Herstel van Wnt-7a en VaZuDo-9 remt de groei van niet-kleincellige longkankercellen 10. De effecten van Wnt7a / Fzd9 worden gemedieerd door de activering van ERK-5, die op zijn beurt, activeert peroxisoom proliferator geactiveerde receptor γ (PPARy) 11,12. Hier tonen we aan dat overexpressie van Wnt7a en Fzd9 resulteert in de onderdrukking van verankering-onafhankelijke groei van een muizen longcarcinoom cellijn. Murine CMT167 cellen werden afgeleid van een longcarcinoom in C57BL / lcrf muizen 13 en werden stabiel getransfecteerd met Wnt7A en Fzd9. Overexpressie van Wnt7A en Fzd9 werden bevestigd door kwantitatieve PCR (Q-PCR) en de functionaliteit van Wnt7A en Fzd9 overexpressie werd bevestigd door stroomafwaartse activering van PPARy.
Protocol
Representative Results
Discussion
In vitro bevestiging van de tumor onderdrukkende functie van signaaleiwitten is moeilijk. Een van de meest rigoureuze testen waarover deze eigenschap onderzoeken is de zachte agar kolonievorming assay. Hier hebben we de zachte agar kolonieformatie test met behulp van een muizen longcarcinoomcellijn stabiel overexpressie Wnt7a en Fzd9 ten opzichte van zijn ouderlijke CMT167 cellijn geïllustreerd.
Er zijn een aantal belangrijke punten om te overwegen met betrekking tot de zachte agar…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by a Merit Award from the U.S. Department of Veterans Affairs, and an NIH grant R01CA1385282522717 to RW.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Cancer Cell Line of Interest | Sigma-Aldrich | 10032302 | CMT-167 Cells |
| Powdered RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-089 | Used to prepare 2X cell culture medium. |
| Liquid RPMI 1650 Medium | Cellgro | 10-040-CV | Referred to as 1X cell culture medium. |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30910.03 | Used to supplement cell culture medium. |
| Penicillin/Streptomycin | CellGro | 30-002-Cl | Used in cell culture medium. |
| Difco Noble Agar | BD Biosciences | 214230 | Used to prepare 1.0% and 0.6% Agar. |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | BP-328-1 | Used in 2X cell culture medium. |
| Trypsin | Cellgro | 25-050-Cl | |
| Sterile Bottle-Top Filters | Fisher | 09-761-126 | Used to sterile filter 2X medium. |
| Lipofectamine Reagent | Invitrogen | 18324-020 | Used in PPAR-RE luciferase assay. |
| 6-well Plates Tissue-culture Treated | |||
| 37 degree C/5% CO2 Incubator | |||
| Chemi-Doc Imager | Bio-Rad | Used to take pictures of colonies. | |
| Quantity One Software | Bio-Rad | Used to count cell colonies. | |
| 15mL Conical Tubes | |||
| 50mL Conical Tubes | |||
| 250mL Erlenmeyer Flasks | |||
| Microwave | |||
| 5mL Serological Pipettes | |||
| Pipette Aid | |||
| Micropipette | |||
| Hemacytometer w/ cover slip | |||
| Pipette Tips | |||
| Inverted Light Microscope | |||
| Centrifuge | |||
| Heat-Resistant Gloves | |||
| Saran Wrap | |||
| Ice Bucket |
Referências
- Puck, T. T., Marcus, P. I., Cieciura, S. J. Clonal growth of mammalian cells in vitro; growth characteristics of colonies from single HeLa cells with and without a feeder layer. J Exp Med. 103, 273-283 (1956).
- Taddei, M. L., Giannoni, E., Fiaschi, T., Chiarugi, P. Anoikis: an emerging hallmark in health and diseases. The Journal of pathology. 226, 380-393 (2012).
- Wend, P., Holland, J. D., Ziebold, U., Birchmeier, W. Wnt signaling in stem and cancer stem cells. Semin Cell Dev Biol. 21, 855-863 (2010).
- Reya, T., et al. A role for Wnt signalling in self-renewal of haematopoietic stem cells. Nature. 423, 409-414 (2003).
- Klaus, A., Birchmeier, W. Wnt signalling and its impact on development and cancer. Nat Rev Cancer. 8, 387-398 (2008).
- Clevers, H. Wnt/beta-catenin signaling in development and disease. Cell. 127, 469-480 (2006).
- Takahashi-Yanaga, F., Kahn, M. Targeting Wnt signaling: can we safely eradicate cancer stem cells. Clin Cancer Res. 16, 3153-3162 (2010).
- De, A. Wnt/Ca2+ signaling pathway: a brief overview. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 43, 745-756 (2011).
- Tennis, M. A., Vanscoyk, M. M., Wilson, L. A., Kelley, N., Winn, R. A. Methylation of Wnt7a is modulated by DNMT1 and cigarette smoke condensate in non-small cell lung cancer). PLoS One. 7, (2012).
- Winn, R. A., et al. Restoration of Wnt-7a expression reverses non-small cell lung cancer cellular transformation through frizzled-9-mediated growth inhibition and promotion of cell differentiation. J Biol Chem. 280, 19625-19634 (2005).
- Winn, R. A., et al. Antitumorigenic effect of Wnt 7a and Fzd 9 in non-small cell lung cancer cells is mediated through ERK-5-dependent activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma. J Biol Chem. 281, 26943-26950 (2006).
- Tennis, M. A., et al. Sprouty-4 inhibits transformed cell growth, migration and invasion, and epithelial-mesenchymal transition, and is regulated by Wnt7A through PPARgamma in non-small cell lung cancer. Mol Cancer Res. 8, 833-843 (2010).
- Steele, J. G., Rowlatt, C., Sandall, J. K., Franks, L. M. Cell surface properties of high- and low-metastatic cell lines selected from a spontaneous mouse lung carcinoma. Int J Cancer. 32, 769-779 (1983).
