Transferência de Gene eficiente em retinas pintainho para célula primária Estudos de Cultura: An Ex-ovo Eletroporação Approach

Resumo

Culturas de células da retina pintinho embrionárias constituem ferramentas importantes para o estudo da biologia de fotorreceptores. Nós desenvolvemos uma técnica de transferência de gene eficiente com base em ex ovo plasmídeo electroporação das retinas antes da cultura. Esta técnica aumenta consideravelmente a eficiência de transfecção através de protocolos disponíveis atualmente, fazendo a manipulação genética viável para este sistema.

Resumo

As culturas enriquecidas com cone fotorreceptoras da retina derivadas de bico embrionárias tornaram-se uma ferramenta indispensável para pesquisadores de todo o mundo que estudam a biologia dos neurônios da retina, particularmente fotorreceptores. As aplicações deste sistema excede investigação fundamental, uma vez que podem ser facilmente adaptados às tecnologias de elevado rendimento para o desenvolvimento de drogas. No entanto, a manipulação genética de fotorreceptores da retina nestas culturas tem provado ser muito desafiador, que levanta uma importante limitação para a utilidade do sistema. Temos recentemente desenvolvido e validado um ex ovo técnica de electroporação plasmídeo que aumenta a taxa de transfecção de células de retina nestas culturas por cinco vezes em comparação com outros protocolos actualmente disponíveis ^1. Neste método pinto embrionário olhos são enucleados no estágio 27, o RPE é removido, ea taça da retina é colocado em uma solução contendo plasmídeo e electroporado usando custom- facilmente construídosfeitos eléctrodos. As retinas são então dissociados e cultivadas utilizando procedimentos padrão. Esta técnica pode ser aplicada a estudos sobre-expressão, bem como para a regulação negativa da expressão do gene, por exemplo, através da utilização de tecnologia RNAi-driven plasmídeo, geralmente atingir a expressão do transgene em 25% da população de fotorreceptores. O formato de vídeo da presente publicação irá tornar esta tecnologia de fácil acesso para os pesquisadores da área, permitindo o estudo da função dos genes em culturas de retina primários. Incluímos também explicações detalhadas sobre as etapas críticas de este procedimento para um resultado de sucesso e reprodutibilidade.

Introdução

Culturas de células dissociadas de retinas de pintainho embrionário têm sido amplamente utilizados para o estudo de vários aspectos da biologia celular de fotorreceptores, incluindo a sua sobrevivência ^{2-9, 10-12} diferenciação, crescimento de neuritos ^13, e mais. As vantagens deste sistema, desenvolvido na década de 1980 por Ruben Adler e colaboradores e aperfeiçoados por suas e de outros grupos ^14-20, residem nas características intrínsecas do pinto como um modelo animal ^21. O grande tamanho do olho do pintainho, mesmo em estádios embrionários, fornece grandes quantidades de material para culturas. Além disso, quando as cu....

Protocolo

Todos os procedimentos descritos neste trabalho foram realizadas de acordo com as orientações recomendadas pelo Animal Care e do Comitê Use da Universidade Johns Hopkins.

1. Ahead of Time: preparação de instrumentos, reagentes e pratos

1. Preparação de Ovos: ovos de galinha fertilizados Incubar Leghorn branco a 37,5 ° C e 60% de humidade relativa durante 5 dias numa incubadora de ovos.
   NOTA: Uma incubadora com capacidade de balanço pode ser útil para padronizar e sincronizar o desenvolvimento embrionário, mas de balanço não é estritamente necessário para o resultado do presente protocolo.
2. O plasmídeo Preparação: <....

Resultados

Aqui apresentamos um protocolo simples para o plasmídeo transfecção em copos de bico da retina enucleados para posterior cultura de células dissociadas. Transfecção é obtida por eletroporação usando fácil de fazer eletrodos personalizados (Figuras 1 - 2). Os parâmetros descritos neste protocolo foram otimizados para obter eficiências de transfecção que variam entre 20 e 27% (com uma média de 22%) (Figura 3D). Note-se que, pelas razões acima expostas, estes resultados sã.......

Discussão

O passo mais crítico para o sucesso deste protocolo é a selecção do estágio apropriado dos embriões. Em publicações anteriores, uma série de estágios embrionários é dada para estas culturas, tipicamente, definida pelos dias de incubação ou embrionárias dias (ED); portanto, é geralmente assumido que a utilização de ED de 5 a 6 ED embriões irá produzir resultados equivalentes. No entanto verificou-se que na fase 27 (ED 5), a eficiência de transfecção será de cerca de 22% da população total de células, tal como indicado ac.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
ECM 830 Electro Square Porator	BTX / Harvard Apparatus	45-0052
Genetrodo, em forma de L, 5 mm Gold Tip	BTX / Harvard Apparatus	45-0115 modelo 512	Eletrodo com ponta de ouro usado como ânodo
Tubulação de poliimida	Vention Medical	feito sob medida	Diâmetro interno: 0,5 mm / espessura da parede: 0,15 - 0,2 mm. Usado para isolar eletrodo com ponta de ouro
Filamento de caixa quadrada de 2,5 mm, largura de 4,5 mm	Sutter Instrument Company	FB245B	Usado para fazer eletrodo catódico
HBSS, sem cálcio, sem magnésio, sem vermelho de fenol	Gibco - Life Technologies	14175-095
Pinça Moloney	Roboz	RS-8254	Serrilhada; Ligeira curva; Pinça Dumont de 4,5
5/45	Roboz	RS-5058	Padrão #5, Ângulo de 45 Graus; Tamanho da Ponta de .10 X .06mm; Micro pinça Bonn de 109mm
, 1x2 dentes	Roboz	RS-5172	; 1x2 Dentes, 0.12 mm Dentes; 3.75" Comprimento; 0.3 mm de Largura da Ponta

" de Comprimento Plataforma de Amarração