Efficiënte Gene Transfer in Chick netvliezen voor primaire cel Cultuurwetenschappen: An<em> Ex-ovo</em> Elektroporatie Aanpak

Summary

Embryonale kuiken netvlies celculturen vormen waardevolle hulpmiddelen voor de studie van fotoreceptor biologie. We hebben een efficiënte genoverdracht techniek gebaseerd op ex ovo plasmide elektroporatie van de netvliezen voorafgaand aan cultuur ontwikkeld. Deze techniek aanzienlijk vergroot transfectie-efficiënties op dit moment beschikbare protocollen, waardoor genetische manipulatie mogelijk voor dit systeem.

Abstract

De kegel fotoreceptor-verrijkte culturen afkomstig van embryonale kuiken netvlies hebben een onmisbaar instrument voor onderzoekers over de hele wereld het bestuderen van de biologie van retinale neuronen, in het bijzonder fotoreceptoren geworden. De toepassingen van dit systeem verder fundamenteel onderzoek, omdat ze gemakkelijk kunnen worden aangepast aan high throughput technieken voor de ontwikkeling van geneesmiddelen. Echter, genetische manipulatie van retinale fotoreceptoren in deze culturen heeft bewezen zeer uitdagend, stellen een belangrijke beperking van de bruikbaarheid van het systeem. We hebben onlangs ontwikkeld en gevalideerd ex ovo plasmide electroporatietechniek dat de snelheid van transfectie van retinale cellen in deze kweken stijgt met vijfvoudige vergelijking met andere momenteel beschikbare protocollen ^1. Bij deze methode embryonale kuiken ogen enucleatie in stap 27, de RPE verwijderd en het netvlies beker wordt geplaatst in een plasmide bevattende oplossing en geëlektroporeerd gebruik gemakkelijk geconstrueerd custom-maakte elektroden. De netvliezen worden vervolgens gedissocieerd en gekweekt met behulp van standaardprocedures. Deze techniek kan worden toegepast op overexpressie studies en de neerwaartse regulatie van genexpressie, bijvoorbeeld via het gebruik van plasmide-aangedreven RNAi technologie, vaak bereiken transgenexpressie in 25% van de fotoreceptor bevolking. De video-indeling van de huidige publicatie zal deze technologie gemakkelijk toegankelijk zijn voor onderzoekers in het veld te maken, waardoor de studie van gen-functie in de primaire retinale culturen. We hebben ook uitgebreide uitleg van de kritische stappen van deze procedure voor een succesvol resultaat en reproduceerbaarheid.

Introduction

Gedissocieerde celkweken uit embryonale kuiken netvlies zijn op grote schaal gebruikt om verschillende aspecten van fotoreceptorcellen celbiologie, inclusief hun overleving ^2-9, differentiatie ^10-12, neuriet uitgroei ¹³ en meer bestuderen. De voordelen van dit systeem, in de jaren 1980 ontwikkeld door Ruben Adler en medewerkers en geperfectioneerd door zijn andere groepen ^14-20, bevinden zich in de intrinsieke kenmerken van het kuiken als diermodel ^21. De grote omvang van het kuiken oog, zelfs in embryonale stadia, levert grote hoeveelheden materiaal te kweken. Bovendien, wanneer cultures worden uitgevoerd met embryonale dag (ED) 5 – 6 retina, 55 – 80% van de stamcellen differentiëren fotoreceptoren ^{14,15,18,22,23,} en omdat ongeveer 86% van de fotoreceptoren in dit dier kegels ^24, deze culturen zijn bijzonder geschikt voor studies gericht op dit celtype.

We hebben onlangs developed en het kenmerk van een eenvoudige techniek die zorgt voor hoge-efficiëntie plasmide transfectie van de cellen in deze kweken, is de bruikbaarheid van dit systeem verbreden door het faciliteren genetische studies missexpression ^1. De ontwikkeling van deze techniek kwam voort uit een leegte in de wetenschappelijke literatuur methoden die een aanvaardbaar niveau van transfectie zou bieden om voor de studie van gen in een cel autonoom. Dit is voor een deel omdat de primaire neuronale culturen zijn notoir moeilijk te transfecteren ^25,26. Enkele van de meest gebruikte technieken die eerder voor dit doel opgenomen chemische transfectie werkwijzen zoals lipofectie of calcium-fosfaat-gemedieerde transfectie, die leiden tot efficiëntie in de orde van 3-5% en kan aanzienlijke toxiciteit ^27-32 uitoefenen. Hoewel het gebruik van plasmiden met een enzymatische reporter systeem het probleem van slechte transfectie-efficiëntie kan omzeilen door het amplificeren van het signaal, ze nietdiscrimineren celspecifieke effecten en de resultaten zijn gebaseerd op een klein celpopulatie die niet representatief zijn voor het geheel kan zijn. Een andere veel gebruikte methode in de chick, RCAS virusinfectie, is alleen van toepassing op delende cellen en dus niet geschikt voor deze primaire retinale kweeksysteem ^33.

In het huidige protocol zijn embryonale kuiken ogen enucleatie in stadium 27 (ED 5), het retinale pigmentepitheel (RPE) is verwijderd en de retinale beker wordt geplaatst in een elektroporatie kamer gevuld met een plasmide bevattende oplossing en geëlektroporeerd met behulp maat elektroden, gevolgd door retinale dissociatie en cultuur met standaardtechnieken ^21. Na optimalisatie procedure we in staat om consistent bereiken transfectie-efficiëntie in de orde van 22% van het totale aantal cellen in kweek en 25% binnen de fotoreceptor populatie alleen zijn geweest zonder de overleving en differentiatie kenmerken van de¹ kweken. Hier geven we een gedetailleerd protocol waarin alle belangrijke stappen van de procedure teneinde het succes en de reproduceerbaarheid van deze techniek waarborgen.

Protocol

Alle procedures in dit werk beschreven werden uitgevoerd volgens de richtlijnen zoals aanbevolen door de Animal Care en gebruik Comite aan de Johns Hopkins University. 1. Ahead of Time: Voorbereiding van instrumenten, reagentia en gerechten Bereiding van Eieren: Incubate Witte Leghorn bevruchte kippeneieren bij 37,5 ° C en 60% relatieve vochtigheid gedurende 5 dagen in een broedmachine. OPMERKING: Een incubator met rockende capaciteit kan nuttig zijn voor het standaardiser…

Representative Results

Hier presenteren we een eenvoudig protocol voor het plasmide transfectie in ontkernde chick netvlies bekers voor latere gedissocieerde celkweek. Transfectie wordt bereikt door elektroporatie met behulp van eenvoudig om aangepaste elektroden (figuren 1-2) te maken. De in dit protocol beschreven parameters zijn geoptimaliseerd om de transfectie efficiëntie die variëren tussen 20 en 27% (met een gemiddelde van 22%) (Figuur 3D) te verkrijgen. Merk op dat, om de bovengenoemde redenen, deze…

Discussion

De meest kritische stap voor het succes van dit protocol is het selecteren van de juiste fase van het embryo. In eerdere publicaties is een aantal embryonale stadia die voor deze culturen doorgaans bepaald door de tijd van incubatie of embryonale dag (ED); dus is het meestal aangenomen dat het gebruik van ED 5 tot ED 6 embryo's zullen gelijkwaardige resultaten opleveren. We hebben echter gevonden dat het podium 27 (ED 5), wordt transfectie-efficiëntie ongeveer 22% van de totale celpopulatie, zoals hierboven vermeld…

Materials

ECM 830 Electro Square Porator	BTX/ Harvard Apparatus	45-0052
Genetrode, L-Shaped, 5 mm Gold Tip	BTX/ Harvard Apparatus	45-0115 model 512	Gold tipped electrode used as anode
Polyimide Tubing	Vention Medical	custom made	Internal Diameter: 0.5mm / wall thickness: 0.15-0.2mm. Used for insulating gold tiped electrode
2.5mm square box filament, 4.5mm wide	Sutter Instrument Company	FB245B	Used to make cathode electrode
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red	Gibco – Life Technologies	14175-095
Moloney forceps	Roboz	RS-8254	Serrated; Slight Curve; 4.5" Length
Dumont tweezers 5/45	Roboz	RS-5058	Pattern #5, 45 Degree Angle; .10 X .06mm Tip Size; 109mm Length
Bonn micro forceps, 1×2 teeth	Roboz	RS-5172	Tying Platform; 1X2 Teeth, 0.12mm Teeth; 3.75" Length; .3mm Tip Width