Эффективное Перенос генов в Чик сетчатки для первичной культуры клеток исследований:<em> Экс-ово</em> Электропорация подход

Summary

Эмбриональные цыпленок культуры сетчатки клеток представляют собой ценный инструмент для изучения биологии фоторецепторов. Мы разработали эффективную методику переноса генов на основе экс ово плазмиды электропорации сетчатки, предшествующих культуры. Этот метод значительно повышает эффективность трансфекции по доступных в настоящее время протоколов, что делает генетические манипуляции посильную для этой системы.

Abstract

Фоторецептора обогащенного культур конус, полученные из эмбриональных куриных сетчатки стали незаменимым инструментом для исследователей во всем мире, изучающих биологию нейронов сетчатки, в частности, фоторецепторов. Приложения этой системы выходят за рамки фундаментальных исследований, так как они легко могут быть приспособлены к высоким технологиям пропускную способность для разработки лекарств. Тем не менее, генетическая манипуляция фоторецепторов сетчатки в этих культурах оказалась очень сложным, что создает важное ограничение полезность системы. Мы недавно разработаны и утверждены бывший ово техники плазмиды электропорации, что увеличивает скорость трансфекции клеток сетчатки в этих культурах в пять раз по сравнению с другими доступных в настоящее время протоколов ^1. В этом методе эмбриональных куриных глаза энуклеировали на стадии 27, ПЭС удаляется, и сетчатки чашки помещают в плазмиду раствор, содержащий и электропорации с использованием легко построить нестандартнойиз электродов. Сетчатки затем диссоциируют и культивируют с использованием стандартных процедур. Эта техника может быть применена к избыточной экспрессии исследований, а также подавлением экспрессии гена, например посредством использования плазмиды приводом технологии RNAi, обычно достижении экспрессии трансгена в 25% населения фоторецепторов. Видео формат данной публикации будет сделать эту технологию легко доступны для исследователей в этой области, что позволяет исследование функции гена в первичных сетчатки культур. Мы также включили подробные объяснения важных шагов этой процедуры для успешного исхода и воспроизводимости.

Introduction

Диссоциированные клеточные культуры из эмбриональных куриных сетчатки были широко используется для изучения различных аспектов фоторецепторов клеточной биологии, в том числе их выживания ^2-9 дифференциации ^10-12 роста невритов ^{13 и} более. Преимущества этой системы, разработанные в 1980-х годах Рубен Адлер и сотрудников и совершенствуется его и других групп ^14-20, проживают в собственных характеристик кур в качестве животной модели ^21. Большой размер куриного глаза, даже при эмбриональных стадиях, обеспечивает большое количество материала для культур. Более того, когда культуры осуществляется с помощью эмбриональных день (ED) 5 – 6 сетчатки, 55 – 80% от их клеток-предшественников дифференцировать, как фоторецепторов ^{14,15,18,22,23,} и примерно с 86% фоторецепторов этого животного конусы ^24, эти культуры являются особенно подходящими для исследований, направленных на этом типе клеток.

Мы недавно развитPED и характеризуется простой метод, который позволяет для высокой эффективности плазмиды трансфекции клеток в этих культурах, тем самым расширяя полезности этой системы путем содействия генетическая missexpression исследования ^1. Развитие этой методики вытекает из пустоты в научной литературе методов, которые обеспечили бы приемлемый уровень трансфекции, чтобы позволить для изучения функции генов в автономном режиме клеток. Это отчасти потому, что первичные нейронов культуры, как известно, трудно трансфекции ^25,26. Некоторые из наиболее часто используемых методов, ранее доступные для этой цели включены химические методы трансфекции, такие как липофекции или опосредованную фосфатом кальция трансфекции, что приводит к повышению эффективности в порядке 3-5% и может оказывать значительное токсичности ^27-32. Хотя использование плазмид с ферментативной системой репортер может обойти проблему низкой эффективности трансфекции путем амплификации сигнала, они недискриминацию эффекты соты, и их результаты основаны на небольшом клеточной популяции, которая не может быть представителем в целом. Другим широко используемым методом в куриных, RCAS вирусная инфекция, это применимо только к пролиферирующих клеток и, таким образом, не подходит для этой первичной сетчатки системы культуры ^33.

В текущем протоколе эмбриональных куриных глаза энуклеировали на этапе 27 (ED 5), сетчатки пигментного эпителия (РПЭ) удаляется, и сетчатки чашки помещают в электропорации камере, заполненной плазмиды, содержащей раствор и подвергали электропорации с использованием заказ Электроды с последующим сетчатки диссоциации и культуры с использованием стандартных методик. ²¹ После оптимизации этой процедуры, мы были в состоянии последовательно достичь эффективности трансфекции порядка 22% от общего числа клеток в культуре и 25% в фоторецепторов населения только, без ущерба для выживания и дифференцировки характеристикикультуры ^1. Здесь мы предлагаем подробный протокол с изложением все важные этапы этой процедуры для того, чтобы обеспечить успех и воспроизводимость этого метода.

Protocol

Все процедуры, описанные в данной работе были выполнены в соответствии с руководящими принципами, рекомендованными уходу и использованию животных комитета в Университете Джонса Хопкинса. 1. Впереди времени: Подготовка приборов, реактивов и блюда Подготовка яйца: …

Representative Results

Здесь мы представляем простой протокол для плазмиды трансфекции энуклеированные куриных сетчатки чашки для последующего диссоциированного культуре клеток. Трансфекция достигается с помощью легко сделать пользовательские электродов (Рисунки 1 – 2) путем электропорации. Пара…

Discussion

Наиболее важным шагом для успеха этого протокола выбрав соответствующий этап эмбрионов. В предыдущих публикациях, ряд эмбриональных стадиях дается для этих культур, как правило, определяется дней инкубации или эмбриональных дней (ED); Таким образом, он, как правило, предполагается, что ?…

Materials

ECM 830 Electro Square Porator	BTX/ Harvard Apparatus	45-0052
Genetrode, L-Shaped, 5 mm Gold Tip	BTX/ Harvard Apparatus	45-0115 model 512	Gold tipped electrode used as anode
Polyimide Tubing	Vention Medical	custom made	Internal Diameter: 0.5mm / wall thickness: 0.15-0.2mm. Used for insulating gold tiped electrode
2.5mm square box filament, 4.5mm wide	Sutter Instrument Company	FB245B	Used to make cathode electrode
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red	Gibco – Life Technologies	14175-095
Moloney forceps	Roboz	RS-8254	Serrated; Slight Curve; 4.5" Length
Dumont tweezers 5/45	Roboz	RS-5058	Pattern #5, 45 Degree Angle; .10 X .06mm Tip Size; 109mm Length
Bonn micro forceps, 1×2 teeth	Roboz	RS-5172	Tying Platform; 1X2 Teeth, 0.12mm Teeth; 3.75" Length; .3mm Tip Width