Mesure de l'anaphylaxie locaux chez la souris

Summary

Les réponses allergiques, caractérisé par l'activation des mastocytes et des basophiles, sont entraînés par la reticulation d'IgE et la libération de médiateurs pro-inflammatoires. Une évaluation quantitative de réactions allergiques peut être obtenue en utilisant le colorant bleu d'Evans pour suivre l'évolution de la perméabilité vasculaire après provocation allergénique.

Abstract

Les réactions allergiques sont le résultat de l'activation des mastocytes et les basophiles, et la libération subséquente de médiateurs pro-inflammatoires et vasoactifs. L'exposition à un allergène chez un individu sensibilisé peut entraîner des symptômes cliniques qui varient de l'érythème mineur à la vie en danger anaphylaxie. Au laboratoire, différents modèles animaux ont été mis au point pour comprendre les mécanismes d'entraînement des réactions allergiques. Nous décrivons ici un procédé détaillé destiné à mesurer les changements dans la perméabilité vasculaire de quantifier les réponses allergiques localisées. Le dosage de l'anaphylaxie locale a été signalée pour la première dans les années 1920, et a été adapté à partir de la technique publié par Kojima et al. en 2007 ^1. Dans cet essai, des souris sensibilisées à l'OVA sont contestées dans l'oreille gauche avec le véhicule et dans l'oreille droite avec l'OVA. Ceci est suivi par une injection intraveineuse de colorant bleu d'Evans. Dix minutes après l'injection de bleu d'Evans, l'animal est euthanasie et le colorant qui s'est épanché danspour les oreilles est extraite pendant une nuit dans du formamide. L'absorbance du colorant extraite est ensuite quantifiée avec un spectrophotomètre. Cette méthode permet de manière fiable une manifestation visuelle et quantifiée d'une réaction allergique locale.

Introduction

Je hypersensibilité de type est médiée par l'antigène induit la reticulation de l'IgE à la surface des mastocytes et des basophiles. Cela se traduit par une dégranulation cellulaire et la libération de médiateurs vasoactifs et pro-inflammatoires telles que l'histamine, la tryptase, et le facteur d'activation des plaquettes ^2. Après la libération de médiateurs préformés pendant la dégranulation, les mastocytes synthétisent et libèrent des prostaglandines et leucotriènes, qui augmentent encore la perméabilité vasculaire ^3. La réponse clinique initiale se produit rapidement et est appelé une "réaction immédiate". Dans la peau, une réponse papule et érythème est facilement visible à quelques minutes de provocation par l'antigène. En fonction de la dose de la difficulté, il est possible d'observer une "réaction en phase tardive" quelques heures plus tard. Fin gonflement de phase est due à un œdème localisé et le recrutement des leucocytes dans les tissus ^2. L'histamine, généralement considéré comme le principal médiateur de participer àréactions allergiques immédiates, agit sur des récepteurs de l'histamine 1 (HR1) exprimé sur les navires et les récepteurs de l'histamine 2 (HR2) exprimé sur le muscle lisse. L'effet combiné augmente le flux sanguin et de la perméabilité vasculaire au niveau du site d'inflammation ^4.

Une variété de modèles animaux d'allergie ont été développées pour étudier les mécanismes impliqués dans l'inflammation allergique, y compris des modèles d'asthme allergique, l'anaphylaxie systémique, et l'anaphylaxie locale. Administration intraveineuse de colorant a été utilisé pour mesurer les réactions allergiques localisées dans des modèles animaux pour près d'un siècle, avec des publications décrivant cette technique datant des années 1920 ^5. Les lapins et les cochons d'Inde ont été les premiers modèles animaux utilisés pour tester les réactions d'hypersensibilité immédiate, et les réponses les plus sensibles ont été généralement dans l'oreille ^5,6. Le test a été validé plus tard pour une utilisation chez les rats et les souris ^{7 8.}

Historiquement,une variété de méthodes expérimentales ont été utilisées, notamment par injection de l'antigène avant l'injection du colorant, du colorant injection avant l'injection de l'antigène, et l'injection simultanée de l'antigène et de colorant. Administration par voie intraveineuse de colorant comme un moyen pour mesurer les réponses allergiques est un dosage polyvalent car il peut être utilisé pour mesurer active, passive, et inverser les réactions passives ^5,9. De nombreux colorants ont été utilisés pour évaluer les réactions allergiques, y compris Bleu Trypan, Pontamine Blue Sky, Evans Bleu, Bleu Geigy 536, et l'encre de Chine ^5,6,9. Une solution de 0,5% de bleu d'Evans est actuellement le colorant de référence utilisé pour mesurer les réponses allergiques de la peau.

La réponse anaphylactique défi est transitoire; l'intensité maximum est atteint dans les 10 – 15 min après l'injection de colorant, et aucune réaction visible si colorant est administrée plus de 30 minutes après la provocation, quelle que soit l'espèce animale utilisées ^9. La quantification de l'extravasation de colorant d'origine étaitment obtenue par la mesure de la taille papule, comme indiqué par le colorant bleu ^9.7. En outre, les chiffres de mastocytes dégranulés peuvent être quantifiés par l'excision de tissus de la peau sur le site de la réaction et coloration au bleu de toluidine ^7. Dégranulation des mastocytes est souvent utilisé comme un marqueur pour cutanée, des réactions allergiques médiées par les IgE, comme les mastocytes sont la principale population de cellules exprimant locale de haute affinité des IgE récepteur FceRI. Techniques spectrophotométriques pour mesurer colorant extravasation dans les tissus ont été développés pour l'anaphylaxie cutanée passive (PCA) chez le rat et la souris ^{10 11} dans les années 1990.

Le protocole de test de l'anaphylaxie locale suivant a été adapté à partir de Kojima et al. ^1, et utilise l'ovalbumine d'oeuf de poulet (OVA) comme antigène pour induire des réponses allergiques. Cependant, les antigènes autres que l'OVA peuvent être utilisés si on le souhaite. Le test utilise ensuite colorant bleu Evans à surveiller les changements dans permeabilit vasculairey qui se produisent en raison de mastocytes IgE réticulation et la libération d'histamine.

Protocol

1. souris Sensibiliser Préparer une solution stock OVA par dilution de l'OVA en 1x PBS à une concentration finale de 20 mg / ml. Congeler bas aliquotes dans des cryotubes et conserver à -80 ° C pour une utilisation future. Apportez un ou plusieurs aliquotes de 20 mg / ml OVA actions à la température ambiante. Diluer OVA dans du PBS 1x à une concentration finale de 1 mg / ml dans un tube en polystyrène de 5 ml à fond rond avec un capuchon. Vortex brièvement pour mélanger. Tou…

Representative Results

Les animaux qui ont subi le test avec succès auront la peau et les yeux qui apparaissent en bleu. PBS animaux sensibilisés ne doivent pas réagir à PBS ou le défi de l'OVA, donc les deux oreilles doivent rester blanc (figure 1A). Chez les animaux sensibilisés OVA, l'oreille recevoir le défi PBS (à gauche) doit être soit complètement blanc ou légèrement bleu de façon localisée au niveau du site d'injection. L'oreille recevoir le défi OVA (à droite) devrait devenir progressi…

Discussion

De nombreux marqueurs de la maladie allergique sont utilisés pour évaluer la force des réactions allergiques suivantes provocation allergénique, y compris les changements dans les niveaux d'histamine circulation, production de cytokines Th2, et le recrutement de cellules dans le liquide broncho dans le cadre de défi des voies respiratoires. Tout en surveillant les changements de ces paramètres est important pour l'étude des réactions allergiques, des marqueurs biologiques ne correspondent pas toujours à…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
BALB/c Mice	The Jackson Laboratory	651
PBS pH 7.4	Quality Biologic	114-058-101
Ovalbumin	Sigma	A5503-10G
Imject Alum	Thermo Scientific	77161	Mix thoroughly before use
Evans Blue Dye	Sigma	E2129
Formamide	Sigma	295876	99%+ Spectrophotometric grade
Isoflurane, USP	Phoenix	NDC 57319-474-06
1cc Insulin syringes	BD	329654
3/10 cc Insulin syringe with 31G needle	Terumo	NDC 100861
27G Needles	BD	305109
Forceps	F.S.T.	11000-12
Surgical scissors	F.S.T.	14070-12
5ml Polystyrene round-bottom tubes	BD Falcon	352058
1.5ml Microcentrifuge tubes	Medical Supply Partners	15-1151
15ml Conical tubes	BD Falcon	352097
Flat-bottom 96 well plate	Costar	3590
Scotch tape
RC2 Rodent Anesthesia System	VetEquip	922100
Vortex Genie 2	Scientific Industries	SI-0236	Model G560 with 3 inch platform