유동 세포 계측법에 의한 고효율 심근에 인간 다 능성 줄기 세포의 분화 및 특성
Summary
이 기사는 효율적으로 선택적으로 참조 마커의 분석은 인구의 동질성과 정체성을 평가하기 위해 유동 세포 계측법 다음에 대한 Wnt 경로를 변조하여 심근에 인간 만능 줄기 세포를 구별하는 자세한 방법을 설명합니다.
Abstract
, 심장 손상을 복구하는 심장 독성이없는 새로운 치료제를 발견하고 정확하게 심장 질환을 모델링하기위한 전략을 향상시키기위한 방법을 개발하기위한 시급한 필요성이있다. 이러한 응용 프로그램은 "접시에"심장 근육을 생성하는 인간의 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC) 기술을 악용 가능성이 높은 열정을 생성하고 있습니다. 최근, 효율적으로 인간 다 능성 줄기 세포 (hPSCs) 발 cardiomyogenic 세포를 생성하는 능력이 크게 다르게 접근 할 수없는 인간 심장의 초기 개발 단계를 모델링 우리에게 새로운 기회를 제공하는, 개선했다. 많은 이전의 방법과는 대조적으로, 심근 분화 프로토콜 세포 응집 또는 티빈 또는 BMP4의 추가를 요구하지 않는 여기서 설명하고 견고 심장 트로포 닌 고도로 양성 세포의 배양을 생성하여 I 및 T (TNNI3, TNNT2) iroquois- 클래스 homeodomain을 단백질IRX-4 (IRX4), 마이 오신 규제 경쇄 2, 심실 / 심장 근육의 이소 형 (MLC2v)과 미오신 규제 경쇄이 모든 인간 배아 줄기 세포 (hESC의)와 hiPSC 라인에서 일 10에 의해 심방 이소 형 (MLC2a는) 테스트 날짜입니다. 세포는 계대와 문화에 90 일 이상 유지 될 수있다. 전략은 기술적으로 구현하기에 간단하고 비용 효과적이다. 다 능성 세포로부터 유도 된 심근 세포의 특성은 종종의 mRNA 및 단백질 수준 모두에서, 기준 마커의 분석을 포함한다. 단백질 분석을 위해, 유동 세포 계측법에 배양 세포의 품질을 평가하고 모집단의 균질성을 결정하기위한 강력한 분석 도구이다. 그러나, 샘플 제조에서 기술 변화는 크게 유동 세포 계측법 데이터의 품질에 영향을 미칠 수있다. 따라서, 염색 프로토콜의 표준화는 다양한 차별화 전략 간의 비교를 용이하게한다. 따라서, IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3 및 TNN의 분석을 위해 염색 프로토콜을 최적화흐름에 의해 T2 세포 계측법에 설명되어 있습니다.
Introduction
hESC의와 hiPSC 포함 hPSCs,에서 심근의 발생은 기계 론적 연구, 그렇지 않으면 접근 할 수없는 단계에 대한 통찰력을 제공하고, 초기 인간의 심장 발달 과정의 체외 모델로 작동 할 수 있습니다. 이 모델 시스템은 심장 계통의 의지와 세포 운명 사양을 제어하는 분자 경로를 연구하는 독특한 기회를 제공합니다. 최근, 효율적 hPSCs에서 cardiomyogenic 세포를 생성하는 능력이 크게 향상되었다 1-15. 그러나, 프로토콜들 세포는 챔버 관련 마커 (예를 들어, 심실과 심방)를 발현하는 세포와 cardiomyogenic 타이밍을 생성하는 효율에 대해 세포주 편차가있다. 이상적으로,이 모델 시스템의 미래 응용 프로그램, 기능적으로 정의 된 세포의보다 균일 한 집단이 요구된다. 이전 방법과 대조적으로, 심근 분화 프로토콜 CE 필요없는 여기서 설명한LL 집계 또는 견고 티빈 또는 뼈 형태 형성 단백질 4 (BMP4)과의 추가는 일에 의해 TNNI3, TNNT2, IRX4, MLC2v 및 MLC2a에 대한 문화가 매우 긍정적 인 일에 테스트 한 모든 hESC의와 hiPSC 라인에 걸쳐 10 세포를 생성합니다. 이 전략은 특히 입체 문화, 대중 문화, 또는 배아 체를 기반으로 전략 4-9에 비해 구현하기가 기술적으로 간단하고, 최근 hPSCs에 대한 선택적 독성을 가진 작은 분자를 설명하는 연구 (Boheler 등으로 정의 하였다. ) 65. 이 프로토콜의 특징은 작은 분자를 사용하여 완전하게 정의 미디어 (아무런 구별 1,2,7,13에서 유사) Wnt 신호를 변조 hESC의 자격을 갖춘 매트릭스 (마트 리겔)의 단일 층을 사용하여 단일 층 문화 hPSCs의 분화를 포함하고, 분화 효율 및 셀 아이덴티티 평가 염색 방법 최적화 유동 세포 계측법. 이전 보고서는 비용 effectiv을 포함에 요약하면,이 프로토콜의 장점을 비교eness, 재현성 및 hiPSC hESC의 라인을 포함하여 여러 hPSC 라인 중 심근를 생성하기위한 고효율.
유동 세포 계측법에 배양 세포의 품질을 평가하고 모집단의 균질성을 결정하기위한 강력한 분석 도구이며, 적절한 실험 설계로, 정량적 측정을 제공 할 수있다. 모든 항체 기반의 전략으로, 실험 결과의 정확한 해석은 하위 최적의 조건이 크게 항체의 효율성에 영향을 미치는로 항체 농도와 고정 및 permeabilization 조건 (세포 내 항원을 표적)을 포함하여 분석 디자인의 요소주의 깊게 각 항체 테스트해야 결과의 해석을 결합하고, 따라서. 정량 분석이 필요하다면 폴리 클로 날 항체가 여러 에피토프를 인식하고 뱃치 변화하는 경향이있다 중요한 것으로, 단일 클론 항체는 필수적이다. 현재 항체의 다양한 (포lyclonal 및 모노클로 날) 및 염색 프로토콜 어려운 프로토콜 1,2,9,11 중 cardiomyogenesis의 효율을 비교하기 위하여, 시험 관내 분화의 평가를 위해 설명되었다. 모든 유동 세포 계측법 분석을 위해 사용 가능한 경우 그 이유를 들어, 단일 클론 항체가 사용된다. 향후, 그것은 더 나은 차별화 전략 간의 비교를 허용해야, 특히 정량와 관련하여,이 염색 프로토콜의 표준화를 것으로 예상된다.
체외 cardiomyogenesis의 순도를 평가하기 위해 사용 된 마커의 선택 및 해당 항체는, 리포트 중에서 변한다. TNNT2는 cardiomyogenic 운명 커밋 세포의 지표로 간주되었으며 심장 일상적 분화 프로토콜의 효율을 평가하기 위해 사용된다. 그러나 TNNT2은 초기 병아리와 쥐 개발 (16, 17) 중 골격근에서 발현과 인간의 평활근 (18)에 존재한다 </sup>. 따라서, TNNT2 반드시 체외에서 인간의 cardiomyogenesis의 특정 마커 없습니다. MLC2v 및 MLC2a 일상적으로 각각 심실 및 심방 하위 유형의 대리 지표로 사용된다. 그러나, 체외 분화의 컨텍스트에서 심근 하위 유형을 판별 MLC2v 및 MLC2a에 의존하고있는 도전이 유전자 산물이 성인 통해 중심 튜브에서, 심장 개발 걸쳐 특정 챔버로 제한되지 않을 수 있다는 사실로부터 발생한다. 짐승의 마음을 루프에서 MLC2a의 mRNA는 심방 / 유입 관의 지역에서 우세하고 MLC2v의 mRNA는 심실 / 유출 요로 지역에서 지배적이다. 루프 중심부에 위치한 MLC2a 및 MLC2v의 mRNA의 공동 발현은 유입 경로, 방실 운하 및 유출 관 (19, 20)에서 관찰된다. 출생 후 삼일으로 MLC2v의 mRNA는 심실로 제한되고, 출생 후 십일에 의해, MLC2a는 신생아 쥐의 심장 (19)에 심방으로 제한됩니다. 따라서 해석cardiomyogenesis 효율성과 하위 정체성은 기준 마커 레벨의 존재와 양을 고려하지해야하지만, 분석 분화 timepoints이 해당하는 발달 단계 (들)을 고려해야한다에 관한 데이터. 이 hPSCs의 체외 분화에 의해 생성 cardiomyogenic 세포의 성숙 단계가 가장 밀접하게 배아 / 태아 발달 21-25들과 유사한 점을 고려 특히 중요합니다. 따라서, 출생 후 심장 마커의 공간 표현에 의존하는 것은 적어도 어떤 경우에는 hPSC 유래 세포의 평가를 위하여는 적절하지 않을 수 있습니다.
체외에서 심근 ID를 정의하는보다 구체적인 기준의 개발을 용이하게하기위한 노력으로, TNNI3는 그것이 병아리 및 지브라 피쉬 15,20에서 배아 걸쳐 심근로 제한으로서 체외에서 cardiomyogenesis을 평가하기위한 유용한 마커로 간주인간 태아의 골격 근육 (26)의 존재이다. TNNI1 인간 태아 심장에 존재하지만, TNNI3 정상 성인의 심장 (27, 28)의 유일한 TNNI 이소 존재입니다. 심근 하위 정체성과 관련하여, IRX4 29 ~ 31는 심실 운명 세포의 정보 마커입니다. 단백질 수준에서 IRX4 최근 마우스 (32)에 신생아 단계를 통해 선형 심장 관에서 심실로 제한하는 것으로 나타났다. 따라서, 유동 세포 계측법에 의해 TNNI3의 분석 및 최적화를위한 IRX4 염색 프로토콜을 설명한다. 우리가 알기로는,이 유동 세포 계측법에 의한 효율적인 항체 기반 염색 인간 심근에 IRX4 수준의 분석을위한 방법의 제 설명이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
분화 프로토콜의 성공에 중요 분화의 개시 전에 적어도 다섯 통로위한 단일 세포 수준에서 계대되었다 hPSCs 고품질 배양의 사용이다. 그들은 세포주 독립적 분화 개시시 100 % 합류, 경우 유사 분화 효율 일상적 다양한 hPSC 라인 중에서 관찰된다. 분화의 개시시 세포의 합류 ≤95 % 또는> 100 % 인 경우 차선 효율이 관찰된다. 따라서, 파종 밀도 및 계대의 타이밍은 분화의 시작에 100 % 컨 플루 언트 단…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 NIH 4R00HL094708-03에 의해 지원되었다, MCW 리서치 업무위원회 새로운 교수 상, 위스콘신 의과 대학 (RLG)에서 컨 재단 (시작 자금); 홍콩 테마 기반의 연구 계획 T13-706 / 11 (KRB)의 연구 보조금위원회; U01 HL099776, CIRM TR3-05556, CIRM DR2A-05394 및 AHA는 탐정 수상 (JCW) 설립; AHA 박사후 원정대 12POST12050254 (PWB). 우리는 데이터 수집 및 원고의주의 깊은 검토에 대한 지원은 위스콘신의 혈액 연구소의 유동 세포 계측법 코어에 희망 캠벨 감사합니다.
Materials
| Name of Reagent / Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Cell Culture | |||
| BD Matrigel, hESC-qualified matrix | BD Biosciences | 354277 | |
| Accutase cell detachment solution | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| Dubelcco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-136 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO, Hybri-Max, sterile-filtered) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | 53817 | |
| Citric acid | Sigma Aldrich | C2404-100G | |
| Y-27632 dihydrochloride selective p160ROCK inhibitor | R&D Systems | 1254 | |
| L-ascorbic acid-2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma Aldrich | A8960-5G | |
| Sodium selenite | Sigma Aldrich | S5261-10G | |
| Transferrin (Optiferrin – Defined, Animal-free, Recombinant Human) | Invitria | 777TRF029 | |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2) | R&D Systems | 4144-TC-01M | |
| Transforming growth factor beta 1 (TGFβ1) | Peprotech | 100-21 | |
| DMEM/F12 with L-Glutamine and 15 mM HEPES | Life Technologies | 11330-032 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I9278-5ML | |
| CHIR-99021 HCl | Sellekchem | S2924 | |
| IWR-1 | Sigma Aldrich | I0161 | |
| RPMI 1640 with L-Glutamine | Life Technologies | 11875-093 | |
| B-27 Supplement Minus Insulin | Life Technologies | A1895601 | |
| B-27 Supplement (with Insulin) | Life Technologies | 17504-044 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10437 | |
| Flow cytometry reagents | |||
| Phosphate buffered saline (10X) | Quality Biological Inc. | 119-069-151 | |
| Hank's balanced salt solution without Ca2+ and Mg2+ | Life Technologies | 14175-095 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | |
| BD Phosflow perm buffer III | BD Biosciences | 558050 | |
| 16% Paraformaldehyde | Thermo Scientific | 28906 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 179957-4L | |
| Acetone | Mallenckrodt Chemicals | 2440-16 | |
| Triton X-100 | Amresco | M236-10ML | |
| Goat serum | Life Technologies | 16210-064 | |
| Trypan blue solution, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| Materials | |||
| 5 ml round bottom polystyrene tube (without cap) | Corning | 352008 | for preparation of cells for flow cytometry |
| 5 ml round bottom polystyrene tube (with 35 µM cell strainer snap cap) | Corning | 352235 | for preparation of cells for flow cytometry |
| 2 ml rubber bulbs | Fischer Scientific | 03-448-24 | |
| 9" borosilicate unplugged glass Pasteur pipets | BioExpress | P-2904-2 | |
| 0.65 mL microcentrifuge tubes, graduated, green | GeneMate | C-3259-G | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes, graduated, red | GeneMate | C-3260-R | |
| TC20 automated cell counter | BioRad | 145-0102 | |
| Counting slides for TC20 | BioRad | 145-0011 | |
| 6 well flat bottom tissue-culture treated plate | Corning | 353046 | |
| 20 mL syringes | BD Plastipak | 300613 | For filter sterilization of aliquots |
| Sterile syringe filters, 0.2 µm polyethersulfone | VWR | 28145-501 | For filter sterilization of aliquots |
| 250 mL filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding | Corning | 431096 | For filter sterilization of bulk media |
| 500 mL filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding | Corning | 431097 | For filter sterilization of bulk media |
| Antibodies and Isotype Controls | |||
| Anti-TNNI3 (clone: 284 (19C7)) | Abcam | ab19615 | Primary antibody |
| Anti-TNNT2 (clone: 1C11) | Thermo Scientific | MA1-16687 | Primary antibody |
| Anti-MYL2 (MLC2v, clone: 330G5) | Synaptic Systems | 310111 | Primary antibody |
| Anti-MYL7 (MLC2a, clone: 4E7) | Abcam | AB131661 | Primary antibody |
| Anti-IRX4 | Bioss | BS-9464R | Primary antibody |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG1 | Life Technologies | A21121 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG2a | Life Technologies | A21241 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG2b | Life Technologies | A21141 | Secondary antibody |
| Phycoerythrin(PE) Goat anti-rabbit IgG | R&D Systems | F0110 | Secondary antibody |
| Mouse IgG1 | BD Biosciences | 557273 | Isotype Control |
| Mouse IgG2a | eBiosciences | 16-4724-81 | Isotype Control |
| Rabbit IgG-PE | R&D Systems | IC105P | Isotype Control |
| TaqMan Probesets for qRT-PCR | |||
| ACTB | Life Technologies | Hs01060665 | |
| Brachyury T | Life Technologies | Hs00610080 | |
| CASQ2 | Life Technologies | Hs00154286 | |
| IRX4 | Life Technologies | Hs01100809 | |
| ISL1 | Life Technologies | Hs00158126 | |
| MESP1 | Life Technologies | Hs01001283 | |
| MYH11 (SMMHC) | Life Technologies | Hs00224610 | |
| MYH6 | Life Technologies | Hs01101425 | |
| MYL2 (MLC2v) | Life Technologies | Hs00166405 | |
| MYL7 (MLC2a) | Life Technologies | Hs01085598 | |
| MYOG | Life Technologies | Hs01072232 | |
| NKX2.5 | Life Technologies | Hs00231763 | |
| NPPA | Life Technologies | Hs01081097 | |
| POU5F1 | Life Technologies | Hs04260367 | |
| SOX17 | Life Technologies | HS00751752 | |
| TNNI1 | Life Technologies | Hs00913333 | |
| TNNI2 | Life Technologies | Hs00268536 | |
| TNNI3 | Life Technologies | HS00165957 | |
| TNNT2 | Life Technologies | Hs00165960 |
Referências
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