Étiquetage spécifique de la séquence des acides nucléiques et des protéines avec Methyltransferases et le cofacteur Analogues
Summary
ADN et les protéines sont-séquence spécifiquement étiquetés avec une affinité ou groupes rapporteurs fluorescents à l'aide ADN ou de protéines méthyltransférases et analogues de cofacteur synthétiques. En fonction de la spécificité du cofacteur des enzymes, aziridine ou doubles analogues de cofacteurs activés sont utilisés pour l'étiquetage d'une ou deux étapes.
Abstract
-Adenosyl S-L-méthionine (SAM ou AdoMet) méthyltransférases dépendantes (MTAse) catalysent le transfert du groupe méthyle de l'AdoMet activé à des positions spécifiques dans l'ADN, l'ARN, les protéines et les petites biomolécules. Cette réaction de méthylation naturel peut être étendue à une grande variété de réactions d'alkylation utilisant des analogues de synthèse de cofacteurs. Remplacement du centre de sulfonium de AdoMet réactif avec un cycle aziridine conduit à des co-facteurs qui peuvent être couplés avec de l'ADN par diverses MTases d'ADN. Ces cofacteurs aziridine peuvent être équipés avec des groupes rapporteurs à différentes positions de la fraction de l'adénine et utilisés pour S spécifique M equence ethyltransferase- je nduced L abel ING de l'ADN (DNA Sourire). Comme exemple typique, nous donnons un protocole de biotinylation de l'ADN de plasmide pBR322 à la séquence 5'-ATCG A T-3 'avec l'ADN MTase M.BseCI et le cofacteur aziridine dans 6BAzune étape. Extension du groupe méthyle activé avec insaturés groupes alkyle résultats dans une autre classe d'analogues AdoMet qui sont utilisés pour m ethyltransferase dirigée de Transfert d'un G roupes ctivated (MTAG). Étant donné que les chaînes latérales longues sont activés par le centre de sulfonium et de la liaison insaturée, ces co-facteurs sont appelés analogues AdoMet double-activées. Ces analogues, non seulement fonction de cofacteurs de l'ADN, comme MTases les co-facteurs d'aziridine, mais aussi pour un ARN, de protéines et de petites molécules. MTases Ils sont généralement utilisés pour la modification enzymatique de substrats MTAse uniques avec des groupes fonctionnels qui sont marqués avec des groupes rapporteurs dans une deuxième étape chimique. Ceci est illustré dans un protocole de marquage par fluorescence de la protéine histone H3. Un petit groupe propargyle est transférée du cofacteur SeAdoYn analogue à la protéine par l'histone H3 lysine 4 (H3K4) MTase Set7 / 9 suivie d'étiquetage du clicalkynylated histone H3 avec TAMRA azoture. Étiquetage MTase médiation avec des analogues de cofacteur est une technologie habilitante pour de nombreuses applications intéressantes, dont l'identification et l'étude fonctionnelle des substrats MTASE ainsi que l'ADN de génotypage et de détection de la méthylation.
Introduction
Étiquetage spécifique d'acides nucléiques et de protéines 1,2 3,4 est d'un intérêt majeur pour les caractérisations fonctionnelles, le diagnostic médical et (nano) la biotechnologie. Nous présentons ici une méthode de marquage enzymatique pour ces biopolymères qui est basé sur S -adenosyl-L-méthionine (SAM ou AdoMet) méthyltransférases dépendantes (de MTases). Cette classe d'enzymes (EC 2.1.1.) Cible nucléophiles positions individuelles (azote, d'oxygène, de soufre et des atomes de carbone) à l'intérieur des résidus spécifiques d'acides nucléiques et de protéines et transfère le groupe méthyle activé de l'AdoMet cofacteur (figure 1A) 5 naturellement. En outre, MTases peuvent utiliser des analogues synthétiques de cofacteurs pour un étiquetage spécifique avec des étiquettes d'affinité, des fluorophores ou d'autres étiquettes (figure 1B) 6. Deux classes d'analogues AdoMet ont été développés: cofacteurs aziridine pour S equence spécifique M ethyltransferase- I </strong> Nduced L abel ING (Sourire) 7 et doubles analogues AdoMet activés pour m ethyltransferase dirigée de Transfert d'un G roupes ctivated (MTAG) 8.
Figure 1: Réactions catalysées par des méthyltransférases (MTases) de transfert de groupe A. méthyle à partir du cofacteur naturel AdoMet (SAM) sur divers substrats, y compris l'ADN, l'ARN, les protéines et les petites biomolécules B. Identification / fonctionnalisation des acides nucléiques et des protéines (NNNNN =.. paires de bases de l'ADN, des nucleotides de l'ARN et des acides aminés pour les protéines; XXXXX = séquence de reconnaissance de la MTase résidu avec de cible en vert) avec des analogues de synthèse de cofacteurs. Cofacteurs aziridine contenant un groupe rapporteur (sphère bleue)fixé au noyau adenine sont séquence spécifique couplé avec le résidu cible (à gauche) et analogues doubles activé AdoMet conduit au transfert de chaînes alkyle étendues portant un reporter chimique Y (à droite) qui peut être marqué par bioorthogonal clic réaction dans une seconde étape. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Cofacteurs aziridine fonctionnent mieux avec des ADN MTases. Ils contiennent un cycle à trois à un atome d'azote 9 (ou un N de moutarde 10,11) à la place du centre de sulfonium en tant que groupe réactif. La protonation de cet atome d'azote active le cycle aziridine pour une attaque nucléophile par le nucléotide cible qui entraîne le couplage covalent de l'ensemble avec de l'ADN cofacteur. En attachant des groupes rapporteurs à l'anneau de l'adénine les cofacteurs d'aziridine peuvent être utilisés en combinaison avec de l'ADN pour marquer MTases ADN en une étape ( <stron g> Figure 1B, de gauche) 7,12. Cela est démontré en détail pour la biotinylation de l'ADN avec 6BAz 13-15 (cofacteur aziridine avec de la biotine attachée à la position 6 du cycle adénine) et l'ADN spécifique à l'adénine MTase de Bacillus stearothermophilus (M.BseCI) 16 (Figure 2, voir la section 2 du protocole: étiquetage en une seule étape de l'ADN via aziridine cofacteurs). En plus de M.BseCI («séquence de reconnaissance, l'ADN MTases à partir de Thermus aquaticus (M.TaqI, 5'-TCG A -3 5'-ATCG Un T-3) '), à partir de Haemophilus heamolyticus (M.HhaI, 5 »-G C GC-3 '), et de Spiroplasma (M.SssI, 5'-C G-3') ont été utilisés avec succès pour biotinyler ADN avec 6BAz 17. En outre, des cofacteurs aziridine peuvent être utilisés pour une étape de marquage d'ADN par fluorescence 18,19.
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Figure 2:. Séquence spécifique à une étape de biotinylation avec M.BseCI ADN et l'ADN MTase 6BAz M.BseCI reconnaît la séquence d'ADN double brin 5'-ATCG A T-3 'et méthylation du groupe amino de la seconde adénine naturellement résidu (vert) en utilisant AdoMet. Avec le cofacteur aziridine 6BAz le cours de la réaction est changé et M.BseCI conduit à séquencer biotinylation spécifique d'ADN en couplant l'ensemble cofacteur y compris biotine (bleu) avec l'adénine cible. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Double analogues activés AdoMet contient étendues de chaînes latérales insaturées au lieu d'un groupe méthyle au centre de sulfonium (figure 1B </strong>, droite) 20. Le double ou triple liaison insaturée dans β-position pour le centre de sulfonium compense électroniquement effets stériques défavorables au sein de l'état de transition par la stabilisation de conjugaison. Étant donné que le centre de sulfonium et activent la liaison insaturée de la chaîne latérale pour le transfert enzymatique, ces co-facteurs ont été nommés analogues AdoMet double-activées. Typiquement, ils sont utilisés pour transférer des chaînes latérales avec des groupes uniques chimiques (reporters chimiques), comme les groupes amino, alcyne et azoture, par chimio-sélective étiquetage dans une deuxième étape 8,21. En général, les analogues doubles activé AdoMet peut non seulement fonctionner comme cofacteurs pour l'ADN MTases 8,20,21 mais aussi pour l'ARN MTases 22,23 et MTases de protéines de 24 à 28 permettant étiquetage supplémentaire de l'ARN et des protéines. Cependant, les longues chaînes latérales sont stériquement plus exigeant que un groupe méthyle et en élargissant les sites actifs MTASE par ingénierie des protéines est souventfr nécessaire pour obtenir des taux de transfert efficaces. Une autre solution à ce problème est d'utiliser un analogue AdoMet avec un petit groupe de propargyle (trois carbones) où l'alcyne terminale sert deux fonctions: 1. La stabilisation de l'état de transition pendant le transfert enzymatique et 2. poignée réactif pour la suite de modifications chimiques de cuivre catalysée cycloaddition azoture-alcyne (CuAAC) click chemistry. Il se est avéré que le propargylique résultant AdoMet analogique 29 est assez instable dans des conditions neutres ou légèrement basiques et seulement d'une utilité limitée. Cet inconvénient peut être résolu en remplaçant l'atome de soufre par le sélénium. Le cofacteur résultant 5 '- [(Se) [(3 S) -3-amino-3-carboxypropyle] prop-2-ynylselenonio] -5'-désoxyadénosine (SeAdoYn, figure 3) est acceptée par l'ADN de type sauvage, l'ARN MTases et de protéines de 30 à 32 qui abroge la nécessité d'ingénierie des protéines dans de nombreux cas. Ceci est illustré par fluorescence pro étiquetage protéine avec l'histone H3 lysine 4 (H3K4) MTase Set7 / 9 33 (Figure 3, voir la section de protocole 3: Deux étapes étiquetage de protéine via doubles cofacteurs activés).
Figure 3:. Spécifique de séquence à deux étapes marquage par fluorescence de l'histone H3 avec Set7 / 9, SeAdoYn et TAMRA azide La protéine MTase Set7 / 9 méthylation naturellement le groupe amino de la lysine 4 de l'histone H3 (H3K4, vert) à l'aide AdoMet. Avec le cofacteur double-activé SeAdoYn l'MTase transfère un petit groupe propargyle (rouge) au résidu de lysine. Le triple liaison terminal connecté est alors modifiée sélectivement en un clic réaction bioorthogonal (cuivre-catalysée azoture-alcyne cycloaddition, CuAAC) avec l'azoture-dérivé TAMRA (tétraméthylrhodamine, bleu) fluorophore.charge / 52014 / 52014fig3highres.jpg "target =" _ blank "> Se il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Protocol
Representative Results
Discussion
Étiquetage en une seule étape de l'ADN avec MTases d'ADN et des cofacteurs d'aziridine (ADN Sourire) est une méthode robuste mais certains aspects doivent être considérés lors de la planification de l'expérience.
Cofacteur aziridine: La concentration 6BAz pour l'étiquetage d'ADN avec M.BseCI était de 60 uM. Lors de l'utilisation d'autres MTases ADN la concentration de cofacteur doit être optimisée, par exemple des concentrations au…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Kerstin Glensk for preparing the MTases M.BseCI and Set7/9 and gratefully acknowledge funding by the Excellence Initiative of the German Federal and State Governments and RWTH Aachen University. The authors are happy to provide 6BAz and SeAdoYn or other cofactor analogues for collaborative research.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 6BAz | Synthesized according to Weinhold et al., Patent number US 8,129,106, published March 6, 2012. | ||
| β-Mercaptoethanol | Serva | 28625 | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | 10304980 | |
| Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | Serva | 10688 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500100 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Serva | 13375 | |
| Bis-Tris | Gerbu | 1304 | |
| Boric acid | Gerbu | 1115 | |
| Bromophenol blue Na salt | Serva | 15375 | |
| Copper(II) sulfate | Aldrich | C1297 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | 10020090 | |
| Coomassie Brilliant Blue | Serva | 17525 | |
| EDTA disodium salt | Gerbu | 1034 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| GelRed (10000x in water) | Biotium | 41003 | |
| Glycerol (99.5%) | Gerbu | 2006 | |
| FastRuler Low Range DNA Ladder | Thermo Scientific | SM1103 | |
| Histone H3 | Expressionplasmid obtained from Dr. Philipp Voigt and Prof. Danny Reinberg; expression and isolation according to T. J. Richmond et al., J. Mol. Biol. 1997, 272, 301-311. | ||
| M.BseCI | Expressionplasmid obtained from Dr. Michael Kokkinidis; expression and isolation according to Kapetaniou et al., Acta Cryst. 2006, F63, 12-14. | ||
| Methanol | Fisher Scientific | 10675112 | |
| Magnesiumchloride hexahydrate | J.T. Baker | 4003 | |
| MOPS | Gerbu | 1081 | |
| Sodium chloride | Gerbu | 1112 | |
| pH strip (Neutralit) | Merck | 1,095,330,001 | |
| pBR322 | Thermo Scientific | SD0041 | |
| R.TaqI (10u/µl) | Thermo Scientific | ER0671 | |
| SeAdoYn | Synthesized according to Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173. | ||
| Set7/9 | Expressionplasmid obtained from Prof. Danny Reinberg, expression and isolation according to D. Reinberg et al., Genes Dev.2002, 16, 479-489. | ||
| Streptavidin | Gerbu | 3058 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma Life Science | A7631 | |
| SDS Granular | Gerbu | 1833 | |
| di-Sodiumhydrogenphosphat | Merck | 106,586 | |
| TAMRA-azide | |||
| TaqI buffer (10x) | Thermo Scientific | B28 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Acros Organics | 42058 | |
| Tris-HCl | Gerbu | 1028 | |
| Tris-X (TRIS-base) | Gerbu | 1018 | |
| Tris(3-hydroxypropyltriazolyl-methyl)amine (THPTA) | Sigma-Aldrich | 762342 |
Referências
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