Croissance dosage à base de Reporter-une analyse systématique de la dégradation des protéines
Summary
Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.
Abstract
La dégradation des protéines par le système ubiquitine-protéasome (UPS) est un mécanisme majeur de la protéine de régulation de l'homéostasie dans tous les eucaryotes. L'approche standard pour déterminer la dégradation des protéines intracellulaires repose sur des tests biochimiques pour suivre la cinétique de la baisse de la protéine. Ces méthodes sont souvent laborieux et fastidieux et donc ne se prêtent pas à des expériences visant à évaluer plusieurs substrats et conditions de dégradation. Comme alternative, les dosages en fonction de la croissance de cellules ont été développés, qui sont, dans leur format classique, point final des analyses qui ne peuvent pas déterminer quantitativement les variations relatives des niveaux de protéines.
Nous décrivons ici une méthode qui détermine fidèlement l'évolution des taux de dégradation des protéines en les couplant à levure cinétique de croissance des cellules. La méthode est basée sur un système de sélection mis en place où l'uracile auxotrophic de URA3 Supprimé par les cellules de levure est sauvé par une protéine rapporteur exogène exprimée, Composé d'une fusion entre le gène URA3 et un déterminant essentiel de la dégradation (de degron). La protéine rapporteur est conçu de telle sorte que sa vitesse de synthèse est constant tandis que le taux de dégradation est déterminé par le degron. Comme la croissance de la cellule dans un milieu déficient en uracile est proportionnelle aux niveaux relatifs de Ura3, la cinétique de croissance dépendent entièrement de la dégradation de la protéine rapporteur.
Cette méthode permet de mesurer avec précision les changements dans la cinétique de dégradation intracellulaire des protéines. Il a été appliqué à: (a) L'évaluation de la contribution relative des facteurs de l'ubiquitine conjugaison connus à la protéolyse (b) E2 enzyme conjuguant structure-fonction des analyses (c) Identification et caractérisation de nouveaux degrons. Application du système à base de URA3 degron- dépasse le domaine de la dégradation des protéines, comme il peut également être adapté à la surveillance des changements de niveaux de protéines associées à d'autres fonctions des voies cellulaires.
Introduction
Le système de dégradation ubiquitine-protéasome est un appareil de régulation principal, qui a été impliquée dans le maintien de l'homéostasie des protéines dans tous les eucaryotes. L'onduleur conjugue initialement plusieurs molécules d'ubiquitine à une protéine cible, après quoi la protéine de poly-ubiquitine marqué est dégradée par le protéasome 26S. Dans la plupart des cas, le taux étape pour l'ubiquitine médiation dégradation limitant est ubiquitylation substrat, médiée par la conjugaison d'enzymes E2 et E3 ligature enzymes (E3 ligases) 1. Par conséquent, la stabilité intracellulaire de protéines spécifiques reflète leur sensibilité à la conjugaison à l'ubiquitine et l'activité de leurs enzymes ubiquitylation apparentées.
Ligases E3 sont les principaux composants de reconnaissance de substrat de l'onduleur. En tant que tels, ces enzymes reconnaissent degrons au sein de leurs substrats qui sont absents ou ne sont pas exposés à leurs isotopes stables 2. Par exemple, de nombreux régulateurs du cycle cellulaire must être synthétisé et dégradé de façon spécifique dans le temps afin de maintenir la progression du cycle cellulaire dans l'ordre. La dégradation de ces protéines est souvent contrôlée par la phosphorylation médiée par les kinases régulées de signalisation cellulaire 3,4. D'autre part, les protéines aberrante-croisés sont reconnus par degrons cryptiques. Ce sont des régions qui sont normalement cachés dans la structure native et sont exposés à la structure perturbation. Ces degrons comprennent des domaines hydrophobes et 5-7 segments intrinsèquement désordonnées 8.
Depuis la découverte de la charnière, le système de l'ubiquitine de la dégradation des protéines et de la caractérisation des bases dans des lysats de réticulocytes 9, la génétique des levures a joué un rôle dans la découverte de plusieurs des composants du système 10 de l'ubiquitine. Le succès de la levure comme organisme modèle pour l'analyse systématique de la dégradation des protéines par l'onduleur est principalement dû au fait que l'onduleur est élevément conservé chez tous les eucaryotes 4, couplée à leur susceptibilité comme un système expérimental. En effet, les systèmes à base de levure sont couramment utilisés pour déchiffrer les mécanismes d'action de l'appareil d'ubiquitination.
L'étude de la dégradation des protéines par des moyens biochimiques nécessite généralement la préparation d'extraits cellulaires. Bien que les protéines de cellules animales peuvent être extraites dans des conditions relativement douces qui préservent les interactions et la fonction des protéines, la présence d'une paroi cellulaire robuste dans la levure 11 exige des conditions de perturbation considérablement plus sévères qui peuvent affecter la récupération des protéines. En effet, différentes procédures de rupture des cellules de levure varient considérablement dans leur capacité à récupérer les protéines intactes dans les montants qui représentent correctement leur abondance cellulaire relative. En outre imprécision est inhérente aux différentes méthodes utilisées pour déterminer les taux de protéines spécifiques de dégradation: expériences métaboliques base étiquetage-pulse-chase '' suivi par immunoprecipitation, pour isoler des protéines spécifiques 12, est souvent pas strictement quantitative. Ainsi, lorsque la dégradation des protéines est comparée par cette méthode, des précautions particulières doivent être prises dans l'interprétation des résultats. Pour contourner cet inconvénient, une solution de rechange cycloheximide (CHX) essai de chasse peut être utilisé 12. Dans cet essai, l'inhibiteur de la traduction est ajouté à des cultures de cellules et des variations temporelles du niveau d'état stable de protéines sont ensuite surveillés. Néanmoins, l'utilisation de CHX est limitée à des protéines relativement courte demi-vie (<90 min), que l'inhibition à long terme de la synthèse de protéine est cytotoxique. En particulier, à la fois des dosages mentionnés ci-dessus nécessitent l'utilisation d'anticorps spécifiques de la protéine, qui ne sont pas toujours disponibles.
Pour surmonter ces limitations techniques, les chercheurs ont développé plusieurs approches qui ne nécessitent pas l'extraction de cellule et de la manipulation directe de la protéine. Une approche est basée sur la mise en place de oui auxotrophiquest souches, obtenues par la délétion des gènes codant pour des enzymes métaboliques essentielles. De tels gènes comprennent HIS3, LEU2, LYS2 et TRP1, codant pour des enzymes nécessaires à la biosynthèse d'acides aminés, ainsi que URA3 qui code pour l'OMP décarboxylase (Ura3), une enzyme essentielle de la biosynthèse de la pyrimidine ribonucléotide. Ura3 a été largement utilisé dans les études de dégradation des protéines. Dans ces essais, l'expression constitutive de Ura3 sauve la croissance des cellules dans un milieu de ura3 déficient en uracile 13. Par conséquent, la déstabilisation Ura3 par la fusion d'une degron peut diminuer la croissance des cellules sur milieu minimum dépourvu d'uracile. Cette méthode a été utilisée dans plusieurs études de dégradation des protéines, y compris l'identification des déterminants de la dégradation 5, E3 ligases 14 et facteurs ubiquitylation auxiliaire 15 et la découverte de nouveaux UPS degrons 16. Toutes ces méthodes employées croissance des cellules sur des plaques de gélose que l'essai de lecture. Cependant, le til critère de croissance (croissance positive / négative), tandis que robuste et efficace, est surtout qualitative et ne fournit pas d'information quantitative qui est important pour l'évaluation de la puissance d'un degron ou la contribution relative des différents facteurs de dégradation auxiliaires.
Nous avons donc mis au point et utilisé des vecteurs de levure et les méthodes de criblage permettant une analyse systématique et quantitative de la dégradation des protéines par le URA3 -degron système de fusion. Le protocole est basé sur un test-à-poignée facile qui mesure la cinétique de la croissance en culture liquide dans des conditions sélectives (SLIG) et sur la génération de courbes de croissance standard. cinétique de croissance de la levure sont caractérisées par trois phases principales – le décalage, l'exponentielle (LOG) et la phase stationnaire. Le calcul de la cinétique de réplication de levure au cours de la phase logarithmique dans des conditions sélectives, qui est déterminée par les niveaux d'expression de la Ura3-degron, fournit une mesure quantitative non biaisée of dégradation des protéines. Ce procédé peut être appliqué à la mesure et la comparaison des taux de plusieurs substrats de l'onduleur de dégradation simultanément dans de multiples souches et dans diverses conditions.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous décrivons ici un essai basé sur la croissance des cellules pour déterminer le taux relatif de dégradation des protéines, appelée «cinétique de croissance en culture liquide dans des conditions sélectives de (Gils). Le test Gils a plusieurs avantages: Il est simple à mettre en place, l'acquisition et l'analyse des données est simple et il est extrêmement modulaire. Par conséquent, Gils peut être appliquée simultanément à plusieurs échantillons dans un format de plaque conviviale multi-puits…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Yuval Reiss and Dr. William Breuer for critically reviewing the manuscript and Omri Alfassy for helping in the development of the Ura3-GFP screen assay. We also thank Dr. M. Hochstrasser and Dr. R. Kulka for plasmids and strains. This work was funded by the Israeli Academy of Sciences (grant 786/08) and by the United States-Israel Binational Scientific foundation (grant 2011253).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Difco yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate | BD Biosciences | 233520 | For yeast growth on SD minimal media. Amino acids to be supplied are: Arginine, Histidine, Isoleucine, Leucine, Lysine, Methionine, Phenylalanine, Threonine, Tryptophan |
| Ammonium sulfate | Sigma – Aldrich | A4418 | |
| Glucose | Sigma – Aldrich | 16325 | |
| Adenine | Sigma – Aldrich | A8626 | |
| Uracil | Sigma – Aldrich | U0750 | |
| Amino acids | Highest purity available | ||
| 96 well plates | Nunc | 167008 | Any other compatible brand can be used |
| Cyclohexamide | Sigma – Aldrich | C7698 | Working conc. 0.5 mg/ml |
| Infinite 200 PRO series | Tecan | For yeast incubation and OD 600 measurements. Any other compatible temp-controled reader can be used | |
| MDTcalc | Experimental software |
Referências
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