记者的增长分析的蛋白质降解的系统分析
Summary
Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.
Abstract
通过泛素 – 蛋白酶体系统（UPS），蛋白质降解是一个主要的调节机制在所有真核生物蛋白的动态平衡。该标准方法测定细胞内蛋白质降解依赖于生化分析了以下的蛋白质下降的动力学。这样的方法通常是费力和费时，因此不适合进行实验，目的是评估多种底物和降解的条件。作为另一种选择，细胞生长为基础的分析已被开发出来，那是，在他们的常规格式，不能定量确定在蛋白质水平的相对变化终点分析。
在这里，我们描述了一种方法，通过它们连接到酵母细胞的生长动力学，忠实地决定改变蛋白质的降解率。该方法是基于已建立的选择系统，其中的URA3的尿嘧啶营养缺陷型-deleted酵母细胞是通过外源表达报告蛋白获救，包括必要的URA3基因和一个退化行列式（降解决定子）之间的融合。报告蛋白被设计成使得它的合成速率是恒定的，而其降解速率由降解决定子确定。作为细胞生长的尿嘧啶缺陷型培养基是成比例的Ura3的相对水平，生长动力学的完全依赖于报告蛋白降解。
这种方法精确测量变化的细胞内蛋白质降解动力学。它适用于：（a）评估称为泛素结合因子蛋白水解（B）的相对贡献E2结合酶结构与功能分析（三）鉴定及新型降解决定子表征。该degron- URA3基于系统的应用超越蛋白降解字段，因为它也可以适用于蛋白质水平与其他细胞途径功能相关联的监视更改。
Introduction
泛素 – 蛋白酶体降解系统是一种主要的调节机，它有牵连的蛋白质稳态中的所有真核生物中的维持。 UPS的最初偶联物多泛素分子，以在此之后，多聚遍在蛋白标记的蛋白质被26S蛋白酶体降解的靶蛋白。在大多数情况下，速率限制为泛素介导的降解步骤是泛素化底物，由E2结合酶和E3结扎酶介导的（E3连接酶）1。因此，特定的蛋白质的细胞内稳定性反映了其易泛素缀合和它们的同源泛素酶的活性。
E3连接酶是UPS的主要底物识别元件。因此，这些内切酶识别它们的底物是不存在或是在其稳定的对应2不暴露于降解决定子。例如，许多的细胞周期调节米乌斯进行合成，并为了保持细胞周期进程，以便降低在时间上的具体方式。这些蛋白质的降解往往是由磷酸化控制，通过细胞信号调节的激酶介导的3,4。另一方面，异常折叠的蛋白质是通过隐蔽降解决定子的认可。这些是通常隐藏在天然结构并且在结构扰动被暴露的区域。这种降解决定子包括疏水区5-7和内在的无序段8。
由于泛素系统的精液发现对蛋白质降解和其基本特征中的网织红细胞裂解物9，酵母遗传学是有助的发现许多泛素系统10的组件。酵母作为模式生物的蛋白质降解的由UPS系统的分析的成功主要是由于这样的事实，所述UPS处于高LY保守的所有真核生物4，再加上他们的顺从作为一个实验系统。的确，基于酵母的系统通常用于破译泛素化机械的作用机制。
研究蛋白质降解的生物化学手段，通常需要准备的细胞提取物。虽然动物细胞的蛋白可以在相对 温和的条件，同时保留蛋白质相互作用和功能下被提取，稳健的细胞壁中酵母11的存在需要相当苛刻的中断条件可能影响蛋白的恢复。事实上，不同的程序，酵母细胞破碎有很大的不同在他们恢复完整蛋白质在正确表示它们的相对丰度的细胞数量的能力。此外误差是固有的用于确定特定蛋白质的降解速率的不同方法：代谢标记为基础的“脉冲追踪”的实验，随后通过QQ，MSNmunoprecipitation，以隔离特定蛋白12，往往不是严格的定量。因此，当蛋白质的降解是由该方法相比，格外小心，应解释结果的行使。为了克服这个缺点，另一种放线菌酮（CHX）追法可聘请了12位。在此测定中，翻译抑制剂加入到细胞培养物和蛋白质的稳态水平的时间变化随后被监视。然而，放线菌酮的使用仅限于蛋白质具有相对短的半衰期（<90分钟），由于长期抑制蛋白质的合成是细胞毒性的。值得注意的是，无论是在上述测定中需要使用蛋白质特异性抗体，这并不总是可用的。
为了克服这些技术限制，研究人员已开发了几种方法，不需要的细胞的提取和蛋白质直接处理。一种方法是基于建立营养缺陷型酵母的圣菌株，通过缺失基因编码的必需的代谢酶的获得。这样的基因包括HIS3，LEU2，LYS2和TRP1，对于所需的氨基酸生物合成的酶的编码，以及URA3，其编码的OMP脱羧酶（的Ura3）的嘧啶核糖核苷酸生物合成的必需酶。的ura3已被广泛用于蛋白质降解研究。在这些测定中，的Ura3的组成型表达拯救的ura3细胞的尿嘧啶缺陷型培养基中生长13。因此，通过降解决定子的融合不稳定的Ura3可以减少对基本培养基中缺乏尿嘧啶的细胞生长。此方法已被应用于各种蛋白质降解的研究，包括降解的识别决定因素5，E3连接酶14和辅助泛素化因子15和新颖的UPS降解决定子16的发现。所有的这些方法中使用的琼脂平板测定法读出的细胞生长。然而，T他生长标准（正/负增长），而健壮和有效的，主要是定性的，并且不提供用于评估降解决定子的效力或各种辅助降解因素的相对贡献重要的定量信息。
因此，我们开发和利用酵母载体和筛选方法的URA3 -degron融合系统使蛋白质降解系统和定量的分析。该协议基于一个易于手柄测定，其测量的生长动力学在选择性条件下（GILS）液体培养和对标准生长曲线的生成。酵母生长动力学的特征在于三个主要阶段 – 滞后，指数（日志）和固定相。计算过程中的选择性的条件下的对数期，这是由的Ura3，降解决定子的表达水平的测定酵母的复制动力学，提供了一个无偏定量测定öF蛋白的降解。这个方法可以适用于测量和比较同时在多种菌株和在各种条件下的多个UPS基材的降解速率。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里，我们描述了基于细胞的生长来确定蛋白质的相对降解率的测定，称为“液体培养基中的生长动力学下的选择性的条件”（GILS）。该GILS法有几个优点：它是简单的设置，数据采集和分析是很简单的，是非常模块化。因此，GILS可以同时应用于多个样品中，可适应于自动化高通量应用的一种用户友好的多井板格式。最重要的是，GILS提供高度可重复的，定量和可靠的数据和比选择为正/负生长?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Yuval Reiss and Dr. William Breuer for critically reviewing the manuscript and Omri Alfassy for helping in the development of the Ura3-GFP screen assay. We also thank Dr. M. Hochstrasser and Dr. R. Kulka for plasmids and strains. This work was funded by the Israeli Academy of Sciences (grant 786/08) and by the United States-Israel Binational Scientific foundation (grant 2011253).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Difco yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate | BD Biosciences | 233520 | For yeast growth on SD minimal media. Amino acids to be supplied are: Arginine, Histidine, Isoleucine, Leucine, Lysine, Methionine, Phenylalanine, Threonine, Tryptophan |
| Ammonium sulfate | Sigma – Aldrich | A4418 | |
| Glucose | Sigma – Aldrich | 16325 | |
| Adenine | Sigma – Aldrich | A8626 | |
| Uracil | Sigma – Aldrich | U0750 | |
| Amino acids | Highest purity available | ||
| 96 well plates | Nunc | 167008 | Any other compatible brand can be used |
| Cyclohexamide | Sigma – Aldrich | C7698 | Working conc. 0.5 mg/ml |
| Infinite 200 PRO series | Tecan | For yeast incubation and OD 600 measurements. Any other compatible temp-controled reader can be used | |
| MDTcalc | Experimental software |
Referências
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