Reporter-baserede vækstassay for systematisk analyse af proteinnedbrydning
Summary
Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.
Abstract
Protein nedbrydning af ubiquitin-proteasom systemet (UPS) er en vigtig reguleringsmekanisme for protein homeostase i alle eukaryoter. Den standard metode til opgørelse af intracellulær proteinnedbrydning afhængig biokemiske analyser for at følge kinetikken af protein tilbagegang. Sådanne fremgangsmåder er ofte besværlige og tidskrævende og derfor ikke egnet til nogle eksperimenter med henblik på at vurdere multiple substrater og nedbrydningsprodukter betingelser. Som et alternativ er der udviklet cellevækst assays, som er i deres konventionelle format, slutpunktsmulighederne assays, som ikke kvantitativt at bestemme de relative ændringer i proteinniveauer.
Her beskriver vi en fremgangsmåde, der nøjagtigt bestemmer ændringer i protein nedbrydningshastigheder ved at koble dem til gær celle-vækstkinetik. Fremgangsmåden er baseret på en etableret selektionssystem, hvor uracil auxotrofi af URA3 -deleted gærceller reddes af en eksogent udtrykte reporter proteinBestående af en fusion mellem den væsentlige URA3-genet og en nedbrydning determinant (degron). Reporterproteinet er udformet således, at dets syntese er konstant, mens dens nedbrydningshastigheden bestemmes af degron. Som cellevækst i uracil-deficient medium er proportional med de relative niveauer af Ura3, vækstkinetik er helt afhængig af reporter proteinnedbrydning.
Denne metode måler nøjagtigt ændringer i intracellulære protein nedbrydningskinetik. Den blev anvendt til: (a) at vurdere den relative bidrag af kendte ubiquitinlignende konjugering faktorer for proteolyse (b) E2 konjugerende enzym struktur-funktion-analyser (c) Identifikation og karakterisering af nye degrons. Anvendelse af degron- URA3 -baseret system, overskrider protein felt nedbrydning, som det også kan tilpasses til at overvåge ændringer af protein, der er forbundet med funktioner i andre cellulære veje.
Introduction
Ubiquitin-proteasom nedbrydning system er en vigtig regulerende maskine, som har været impliceret i opretholdelsen af protein homeostase i alle eukaryoter. UPS oprindeligt konjugater flere ubiquitin-molekyler til et målprotein hvorefter poly-ubiquitin-mærkede protein nedbrydes af 26S-proteasomet. I de fleste tilfælde, det hastighedsbegrænsende trin for ubiquitin medieret nedbrydning er substrat ubiquitylering, medieret af E2 konjugering enzymer og E3 ligering enzymer (E3 Ligaser) 1. Følgelig intracellulære stabilitet af specifikke proteiner afspejler deres følsomhed over for ubiquitin-konjugation og aktiviteten af deres beslægtede ubiquitylering enzymer.
E3 ligaser er de vigtigste komponenter i UPS substrat anerkendelse. Som sådan disse enzymer genkender degrons inden for deres substrater, der enten fraværende eller ikke eksponeret i deres stabile kolleger 2. For eksempel har mange regulatorer af cellecyklus must syntetiseres og nedbrydes i en tidsmæssigt specifik måde for at holde cellecyklusprogression i orden. Nedbrydningen af disse proteiner styres ofte ved phosphorylering, medieret af cellesignalerende regulerede kinaser 3,4. På den anden side er aberrant foldede proteiner anerkendt gennem kryptiske degrons. Disse regioner, der normalt skjult i native struktur og er udsat på struktur forstyrrelse. Sådanne degrons omfatter hydrofobe domæner 5-7 og uløseligt uordnede segmenter 8.
Siden den skelsættende opdagelse af ubiquitin-system for proteinnedbrydning og karakterisering af dens fundamentale i reticulocytlysater 9, gærgenetik var medvirkende til at opdage mange af komponenterne i ubiquitin 10. Succesen af gær som en model organisme for systematisk analyse af proteinnedbrydning af UPS skyldes primært det faktum, at UPS er højly bevaret i alle eukaryoter 4, kombineret med deres modtagelighed som et eksperimentelt system. Faktisk er gær-baserede systemer, der almindeligvis anvendes til at dechifrere de virkningsmekanismer af ubiquitylering maskiner.
Studere proteinnedbrydning ved biokemiske teknikker kræver normalt fremstilling af celleekstrakter. Mens animalske celle proteiner kan udvindes under relativt milde betingelser, der bevarer protein interaktioner og funktion, og tilstedeværelsen af en robust cellevæg i gær 11 kræver betydeligt hårdere afbrydelse betingelser, som kan påvirke oprensning af proteiner. Faktisk forskellige procedurer for gær cellesprængning varierer betydeligt i deres kapacitet til at inddrive intakte proteiner i mængder, som korrekt svarer til deres relative cellulære overflod. Yderligere unøjagtighed er iboende i de forskellige metoder, der anvendes til bestemmelse af nedbrydningsprodukter satser specifikke proteiner: metabolisk mærkning-baserede "puls-chase eksperimenter efterfulgt af immunoprecipitation at isolere specifikke proteiner 12, er ofte ikke strengt kvantitative. Således, når proteinnedbrydning sammenlignes ved denne metode, ekstra forsigtighed bør udvises i fortolkningen af resultaterne. For at omgå denne ulempe, kan en alternativ cycloheximid (CHX) chase assay anvendes 12. I dette assay er oversættelsen inhibitor tilsat til cellekulturer og tidsmæssige ændringer i protein steady state-niveauerne efterfølgende overvåges. Ikke desto mindre er brugen af CHX begrænset til proteiner med relativt korte halveringstider (<90 min), som på lang sigt hæmning af proteinsyntese er cytotoksisk. Især begge de ovennævnte assays kræver anvendelse af protein-specifikke antistoffer, som ikke altid er tilgængelige.
For at overvinde disse tekniske begrænsninger, har forskere udviklet flere metoder, der ikke kræver celleekstraktion og direkte håndtering protein. Én fremgangsmåde er baseret på etablering af auxotrofe jast-stammer, fremstillet ved sletning af gener, der koder væsentlige metaboliske enzymer. Sådanne gener indbefatter HIS3, LEU2, LYS2 og TRP1, der koder for enzymer, der er nødvendige for aminosyrebiosyntese samt URA3, som koder for OMP-decarboxylase (Ura3), et essentielt enzym pyrimidin ribonukleotid biosyntese. Ura3 har været meget anvendt i proteinnedbrydningsprodukter studier. I disse assays, konstitutiv ekspression af Ura3 redder væksten af URA3-celler i uracil-deficient medium 13. Derfor kan destabilisere Ura3 ved fusion af en degron formindske cellevækst på minimalt medium, der manglede uracil. Denne metode er blevet anvendt i forskellige protein nedbrydningsundersøgelser, herunder identifikation af nedbrydning determinanter 5, E3 ligaser 14 og hjælpeudstyr ubiquitylering faktorer 15 og opdagelsen af nye UPS degrons 16. Alle disse metoder anvendes cellevækst på agarplader som assay udlæsning. Dog, tHan vækst kriterium (positiv / negativ vækst), mens robust og effektiv, er for det meste kvalitativ og ikke give kvantitative oplysninger, der er vigtig for at vurdere en degron potens eller det relative bidrag af forskellige hjælpestoffer nedbrydning faktorer.
Vi har derfor udviklet og anvendt gær vektorer og screeningsmetoder muliggør systematisk og kvantitativ analyse af proteinnedbrydning ved URA3 -degron fusion system. Protokollen er baseret på en let håndterlige assay, der måler Vækstkinetik i flydende kultur under selektive betingelser (Gils) og dannelsen af faste vækstkurver. Gær vækstkinetik er karakteriseret ved tre hovedfaser – forsinkelse, den eksponentielle (log) og den stationære fase. Beregning af gær replikation kinetik under log-fase under selektive betingelser, som er bestemt af niveauet af ekspression af Ura3-degron tilvejebringer en objektiv kvantitativ måling of proteinnedbrydning. Denne metode kan anvendes til at måle og sammenligne nedbrydningshastigheder af multiple UPS substrater samtidigt i flere stammer og under forskellige forhold.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi en assay baseret på cellevækst til bestemmelse af relativ proteinnedbrydningsprodukter satser, såkaldte "Vækstkinetik i flydende kultur under selektive betingelser« (Gils). Den Gils analyse har flere fordele: Det er nemt at sætte op, indsamling og analyse af data er ligetil, og det er yderst modulær. Følgelig kan Gils anvendes samtidig på flere prøver på en brugervenlig multi-brønds plade-format, der kan tilpasses til automation for højt gennemløb applikationer. Vigtigst er det, Gils …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Yuval Reiss and Dr. William Breuer for critically reviewing the manuscript and Omri Alfassy for helping in the development of the Ura3-GFP screen assay. We also thank Dr. M. Hochstrasser and Dr. R. Kulka for plasmids and strains. This work was funded by the Israeli Academy of Sciences (grant 786/08) and by the United States-Israel Binational Scientific foundation (grant 2011253).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Difco yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate | BD Biosciences | 233520 | For yeast growth on SD minimal media. Amino acids to be supplied are: Arginine, Histidine, Isoleucine, Leucine, Lysine, Methionine, Phenylalanine, Threonine, Tryptophan |
| Ammonium sulfate | Sigma – Aldrich | A4418 | |
| Glucose | Sigma – Aldrich | 16325 | |
| Adenine | Sigma – Aldrich | A8626 | |
| Uracil | Sigma – Aldrich | U0750 | |
| Amino acids | Highest purity available | ||
| 96 well plates | Nunc | 167008 | Any other compatible brand can be used |
| Cyclohexamide | Sigma – Aldrich | C7698 | Working conc. 0.5 mg/ml |
| Infinite 200 PRO series | Tecan | For yeast incubation and OD 600 measurements. Any other compatible temp-controled reader can be used | |
| MDTcalc | Experimental software |
Referências
- Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annual review of biochemistry. 67, 425-479 (1998).
- Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 679-689 (2008).
- Willems, A. R., et al. SCF ubiquitin protein ligases and phosphorylation-dependent proteolysis. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 354, 1533-1550 (1999).
- Tyers, M., Jorgensen, P. Proteolysis and the cell cycle: with this RING I do thee destroy. Curr Opin Genet Dev. 10, 54-64 (2000).
- Johnson, P. R., Swanson, R., Rakhilina, L., Hochstrasser, M. Degradation signal masking by heterodimerization of MATα2 and MAT a1 blocks their mutual destruction by the ubiquitin-proteasome pathway. Cell. 94, 217-227 (1998).
- Furth, N., et al. Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope. Molecular Biology of the Cell. 22, 4726-4739 (2011).
- Fredrickson, E. K., Gallagher, P. S., Clowes Candadai, S. V., Gardner, R. G. Substrate recognition in nuclear protein quality control degradation is governed by exposed hydrophobicity that correlates with aggregation and insolubility. J Biol Chem. 10, (2013).
- Rosenbaum, J. C., et al. Disorder Targets Misorder in Nuclear Quality Control A Disordered Ubiquitin Ligase Directly Recognizes Its Misfolded Substrates. Molecular cell. 41, 93-106 (2011).
- Ciechanover, A., Hod, Y., Hershko, A. A heat-stable polypeptide component of an ATP-dependent proteolytic system from reticulocytes. Biochemica., & Biophysical Research Communications. 81, 1100-1105 (1978).
- Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genética. 192, 319-360 (2012).
- Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. Cell wall construction in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 23, 185-202 (2006).
- Zhou, W., Ryan, J. J., Zhou, H. Global analyses of sumoylated proteins in Saccharomyces cerevisiae. Induction of protein sumoylation by cellular stresses. J Biol Chem. 279, 32262-32268 (2004).
- Alani, E., Kleckner, N. A new type of fusion analysis applicable to many organisms: protein fusions to the URA3 gene of yeast. Genética. 117, 5-12 (1987).
- Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation. Genes Dev. 15, 2660-2674 (2001).
- Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. EMBO J. 25, 533-543 (2006).
- Gilon, T., Chomsky, O., Kulka, R. G. Degradation signals for ubiquitin system proteolysis in Saccharomyces cerevisiae. Embo J. 17, 2759-2766 (1998).
- Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast 2 repressor. Cell. 61, 697-708 (1990).
- Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. J Biol Chem. 283, 32302-32316 (2008).
- Guthrie, C., Fink, G. R. . Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. 194, (1991).
- Carvalho, P., Goder, V., Rapoport, T. A. Distinct ubiquitin-ligase complexes define convergent pathways for the degradation of ER proteins. Cell. 126, 361-373 (2006).
- Denic, V., Quan, E. M., Weissman, J. S. A luminal surveillance complex that selects misfolded glycoproteins for ER-associated degradation. Cell. 126, 349-359 (2006).
- Wu, P. Y., et al. A conserved catalytic residue in the ubiquitin-conjugating enzyme family. Embo J. 22, 5241-5250 (2003).
- Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. 5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics. Methods Enzymol. 154, 164-175 (1987).
- Alfassy, O. S., Cohen, I., Reiss, Y., Tirosh, B., Ravid, T. Placing a disrupted degradation motif at the C terminus of proteasome substrates attenuates degradation without impairing ubiquitylation. J Biol Chem. 288, 12645-12653 (2013).
- Cronin, S. R., Hampton, R. Y. Measuring protein degradation with green fluorescent protein. Methods in Enzymology. 302, 58-73 (1999).
