Reporter-basierten Wachstumstest für die systematische Analyse von Proteinabbau
Summary
Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.
Abstract
Der Proteinabbau durch das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) ist ein wichtiger Regulationsmechanismus für Proteinhomöostase in allen Eukaryonten. Die Standardmethode zur Bestimmung der intrazellulären Proteinabbaus beruht auf biochemischen Assays für folgende die Kinetik der Proteinniedergang. Solche Verfahren sind oft umständlich und zeitaufwendig und daher nicht zugänglich sind Versuche zur Beurteilung mehrere Substrate und Abbaubedingungen ab. Als Alternative wurden Zellwachstum basierenden Assays entwickelt worden, die sich in ihrer herkömmlichen Format Endpunktassays, die nicht quantitativ relativen Veränderungen in der Proteinspiegel zu bestimmen können.
Hier beschreiben wir eine Methode, die originalgetreu bestimmt Veränderungen in der Proteinabbauraten durch Kopplung an Hefezelle-Wachstumskinetik. Das Verfahren basiert auf einem System, in dem festgelegten Auswahl Uracil-Auxotrophie des URA3 -deleted Hefezellen durch eine exogen exprimierten Reporterproteins gerettet basierend, Einer Fusion zwischen dem wesentlichen URA3-Gen und einem Abbau Determinante (Degron) besteht. Das Reporterprotein ist so ausgelegt, dass ihre Syntheserate konstant ist, während seine Abbaurate wird durch die Degron bestimmt. Zellwachstum in Uracil-defizientem Medium proportional zu der relativen Pegel Ura3 sind Wachstumskinetik völlig abhängig von der Reporter-Protein-Abbau.
Diese Methode misst genau Veränderungen der intrazellulären Proteinabbau Kinetik. (A) Die Beurteilung der relative Beitrag der bekannten Ubiquitinkonjugierenden Faktoren Proteolyse (b) E2 konjugierende Enzym Struktur-Funktions-Analysen (c) Identifizierung und Charakterisierung von neuen degrons: Es wurde angewandt. Anwendung des degron- URA3 -basierten System überwindet die Abbaufeld Protein, wie es auch zur Überwachung von Veränderungen der Proteinspiegel mit Funktionen der anderen zellulären Wege angepasst zu werden.
Introduction
Das Ubiquitin-Proteasom-Abbausystem ist ein Hauptregulierungs Maschine, die bei der Aufrechterhaltung der Homöostase Protein in Eukaryoten beteiligt ist. Der UPS-Konjugate zunächst mehrere Ubiquitin-Moleküle an ein Zielprotein nach der die Poly-Ubiquitin-markierten Protein durch das 26S Proteasom abgebaut. In den meisten Fällen ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt für die Ubiquitin-vermittelten Abbau Substrat Ubiquitinierung von E2 konjugierenden Enzyme und Liga E3-Enzymen (E3 Ligasen) 1. Folglich intrazelluläre Stabilität spezifischer Proteine spiegelt ihre Anfälligkeit für Ubiquitin-Konjugation und die Aktivität ihres zugehörigen Ubiquitinierung Enzyme.
E3-Ligasen sind die Hauptsubstraterkennung Komponenten des UPS. Als solche sind diese Enzyme erkennen degrons innerhalb ihrer Substrate, die entweder nicht vorhanden oder nicht in ihrer stabilen Gegen 2 ausgesetzt sind. Zum Beispiel sind viele Regulatoren des Zellzyklus must synthetisiert und in einer zeitlich bestimmten Weise, um die Zellzyklusprogression in Ordnung zu halten abgebaut werden. Der Abbau dieser Proteine wird häufig durch Phosphorylierung gesteuert durch zelluläre Signale regulierte Kinasen 3,4 vermittelt. Auf der anderen Seite, sind aberrant-gefaltete Proteine durch kryptische degrons anerkannt. Dies sind Bereiche, die normalerweise in der nativen Struktur verborgen sind und werden beim Aufbau Störung ausgesetzt. Solche degrons gehören hydrophoben Domänen 5-7 und intrinsisch ungeordneten Segmente 8.
Da der Samen Entdeckung des Ubiquitin-Proteinabbau und Charakterisierung der Grundlagen in Retikulozyten-Lysaten 9 war Hefegenetik an der Entdeckung von vielen der Komponenten des Ubiquitin-Systems 10. Der Erfolg von Hefe als Modellorganismus für die systematische Analyse von Proteinabbau durch die USV ist vor allem aufgrund der Tatsache, dass die USV ist hochly konserviert in allen Eukaryoten 4, verbunden mit ihrer Zugänglichkeit als Versuchssystem. Tatsächlich werden auf Hefe basierenden Systemen üblicherweise verwendet, um die Wirkmechanismen der Ubiquitinierung Maschinen entziffern.
Studieren Proteinabbau durch biochemische Mittel erfordert in der Regel Herstellung von Zellextrakten. Während tierische Zellproteinen kann unter relativ milden Bedingungen, die Proteinwechselwirkungen und Funktion zu erhalten extrahiert werden, das Vorhandensein eines robusten Zellwand der Hefe 11 benötigt deutlich härteren Bedingungen, die Störung der Proteingewinnung beeinflussen können. Tatsächlich unterschiedliche Verfahren für Hefe Zellaufschluss variieren erheblich in ihrer Fähigkeit, intakte Proteine in Mengen, die ihre relative Zellüberfluss korrekt darstellen zu erholen. Weitere Ungenauigkeit ist inhärent in den verschiedenen zur Bestimmung Abbauraten von spezifischen Proteinen angewandten Methoden: Metabolische Markierung basierten 'Pulse-Chase-Experimente, gefolgt von immunoprecipitation, um spezifische Proteine 12 zu isolieren, ist häufig nicht streng quantitativ. Somit wird, wenn Proteinabbau wird durch dieses Verfahren im Vergleich, extra Vorsicht bei der Interpretation der Ergebnisse geboten. Um diesen Nachteil zu umgehen, kann eine alternative Cycloheximid (CHX) chase Assay verwendet werden 12. In diesem Assay wird die Übersetzung Inhibitor-Zellkulturen und zeitlichen Veränderungen der Protein stationären Ebenen hinzugefügt werden anschließend überwacht. Dennoch ist die Verwendung von CHX Proteine mit relativ kurzen Halbwertszeiten (<90 min), als langfristige Hemmung der Proteinsynthese ist zytotoxisch beschränkt. Bemerkenswert ist, beide der oben genannten Tests erfordern die Verwendung von Protein-spezifischen Antikörpern, die nicht immer verfügbar sind.
Um diese technischen Einschränkungen zu überwinden, haben die Forscher mehrere Ansätze, die nicht Zellextraktion und direkte Protein Handhabung erfordern entwickelt. Ein Ansatz basiert auf der Einrichtung von auxotrophen yea basiertst Stämme, durch die Deletion von Genen wesentlichen metabolischen Enzyme codieren, erhalten werden. Solche Gene umfassen HIS3, LEU2, LYS2 und TRP1, kodierend für Enzyme, die für die Aminosäure-Biosynthese erforderlich ist, als auch URA3, die OMP-Decarboxylase codiert (Ura3), ein essentielles Enzym der Pyrimidin-Biosynthese Ribonukleotid. Ura3 wurde vielfach in der Proteinabbaustudien eingesetzt. In diesen Assays rettet konstitutive Expression Ura3 Wachstum von Zellen in ura3 Uracil-Mangelmedium 13. Folglich Destabilisierung Ura3 durch die Fusion einer Degron kann das Zellwachstum auf Minimalmedium ohne Uracil verringern. Diese Methode wurde in verschiedenen Proteinabbaustudien eingesetzt, einschließlich der Festlegung von Abbaufaktoren 5, E3 Ligasen 14 und Hilfs Ubiquitinierung Faktoren 15 und die Entdeckung von neuen USV degrons 16. Alle diese Verfahren verwendet das Zellwachstum auf Agarplatten als Testanzeige. Jedoch ter Wachstumskriterium (positive / negative Wachstum), während robuste und effiziente, ist meist qualitative und nicht quantitative Informationen, die wichtig für die Bewertung Potenz eines Degron oder den relativen Beitrag der verschiedenen Hilfsabbaufaktoren ist.
Wir haben daher entwickelt und verwendet Hefevektoren und Screeningverfahren zur systematischen und quantitativen Analyse der Proteinabbau durch das URA3 -degron Fusionssystem. Das Protokoll basiert auf einer einfach zu handhabenden Test, der Wachstumskinetik misst in Flüssigkultur unter selektiven Bedingungen (GIL) und auf der Erzeugung von Standardwachstumskurven. Lag die exponentielle (log) und der stationären Phase – Hefe Wachstumskinetik werden durch drei Hauptphasen gekennzeichnet. Berechnung der Hefe-Replikations Kinetik während der log-Phase unter selektiven Bedingungen, die durch die Höhe der Expression des URA3-Degron bestimmt wird, liefert eine objektive quantitative Messung of Proteinabbau. Dieses Verfahren kann zum Messen und Vergleichen Abbauraten von mehreren UPS Substrate gleichzeitig in mehrere Stämme und unter verschiedenen Bedingungen verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir einen Test auf Basis von Zellwachstum zur Bestimmung der relativen Proteinabbauraten, genannt 'Wachstumskinetik in Flüssigkultur unter selektiven Bedingungen "(GIL). Die Gils Assay hat mehrere Vorteile: Es ist einfach einzurichten, Datenerfassung und Analyse ist einfach und es ist extrem modular ist. Folglich GILS können gleichzeitig mehrere Proben in einer benutzerfreundlichen Multi-Well-Plattenformat, die angepasst werden können, um für Anwendungen mit hohem Durchsatz Automatisierung …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Yuval Reiss and Dr. William Breuer for critically reviewing the manuscript and Omri Alfassy for helping in the development of the Ura3-GFP screen assay. We also thank Dr. M. Hochstrasser and Dr. R. Kulka for plasmids and strains. This work was funded by the Israeli Academy of Sciences (grant 786/08) and by the United States-Israel Binational Scientific foundation (grant 2011253).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Difco yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate | BD Biosciences | 233520 | For yeast growth on SD minimal media. Amino acids to be supplied are: Arginine, Histidine, Isoleucine, Leucine, Lysine, Methionine, Phenylalanine, Threonine, Tryptophan |
| Ammonium sulfate | Sigma – Aldrich | A4418 | |
| Glucose | Sigma – Aldrich | 16325 | |
| Adenine | Sigma – Aldrich | A8626 | |
| Uracil | Sigma – Aldrich | U0750 | |
| Amino acids | Highest purity available | ||
| 96 well plates | Nunc | 167008 | Any other compatible brand can be used |
| Cyclohexamide | Sigma – Aldrich | C7698 | Working conc. 0.5 mg/ml |
| Infinite 200 PRO series | Tecan | For yeast incubation and OD 600 measurements. Any other compatible temp-controled reader can be used | |
| MDTcalc | Experimental software |
Referências
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