タンパク質分解の体系的な分析のためのレポーターベースの成長アッセイ
Summary
Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.
Abstract
ユビキチン – プロテアソーム系（UPS）によるタンパク質分解は、すべての真核生物におけるタンパク質ホメオスタシスのための主要な調節機構である。細胞内タンパク質分解を決定する標準的なアプローチは、タンパク質の減少の速度論に従うための生化学的アッセイに依存している。そのような方法は、多くの場合、面倒で時間がかかり、複数の基板や劣化状態を評価することを目的とした実験に、したがって適していない。別の方法として、細胞増殖に基づくアッセイは、定量的にタンパク質レベルの相対的変化を決定することができないそれらの従来のフォーマット、エンドポイントアッセイであることが、開発されてきた。
ここでは、忠実に酵母細胞増殖速度にそれらを結合することによって、タンパク質分解速度の変化を決定する方法を説明する。この方法は、URA3のウラシル要求性酵母細胞が外因的に発現されるレポータータンパク質によって救助され-deleted確立選択システムに基づいています、本質的なURA3遺伝子および分解行列式（デグ）の間の融合から成る。レポータータンパク質は、その分解速度は、デグロンによって決定され、一方、その合成速度が一定になるように設計されている。ウラシル欠損培地における細胞増殖はUra3遺伝子の相対的なレベルに比例するように、成長速度は、レポータータンパク質の分解に完全に依存している。
この方法は、正確に細胞内タンパク質分解速度の変化を測定する。 （a）は、E2結合酵素の構造と機能は、（c）の同定と新規デグロンの特性を分析し、タンパク質分解、（b）は、既知のユビキチン結合因子の相対的寄与を評価する：これは、に適用した。それはまた、他の細胞経路の機能に関連するタンパク質レベルの変化を監視するに適合させることができるようにdegron- URA3ベースのシステムの適用は、タンパク質分解フィールドを越え。
Introduction
ユビキチン – プロテアソーム分解系は、全ての真核生物におけるタンパク質恒常性の維持に関与している主要な調節機である。 UPSは、最初にポリユビキチン標識タンパク質は26Sプロテアソームによって分解された後、標的タンパク質に複数のユビキチン分子をコンジュゲート。ほとんどの場合、ユビキチン媒介性分解のための律速段階は、E2は酵素を結合させると、E3は酵素（E3リガーゼ）1を連結することによって仲介される、基質ユビキチン化である。結果的に、特定のタンパク質の細胞内安定性は、ユビキチン抱合とその同族ユビキチン化酵素の活性に対する感受性を反映している。
E3リガーゼは、UPSの主な基質認識コンポーネントです。このように、これらの酵素は、その安定した対応2で露光存在しないかのいずれかであるそれらの基質内デグロンを認識する。細胞周期mの例えば、多くの規制当局USTのために細胞周期の進行を維持するために一時的に特定の方法で合成され、分解される。これらのタンパク質の分解は、多くの細胞シグナル調節キナーゼ3,4によって媒介されるリン酸化によって制御される。一方、異常に折り畳まれたタンパク質は、不可解なデグロンを通じて認識される。これらは通常、天然の構造に隠されていると構造摂動時にさらされている領域である。このようなデグロンは、疎水性ドメイン5-7と本質的に無秩序セグメント8が含まれています。
網状赤血球溶解物9でのファンダメンタルズのタンパク質分解および特性のためのユビキチンシステムの独創的発見以来、酵母遺伝学は、ユビキチンシステム10の構成要素の多くを発見に尽力した。 UPSによるタンパク質分解の体系的な分析のためのモデル生物として酵母の成功は、UPSが高いという事実に主に起因しているLyは実験システムとしての従順と相まって、すべての真核生物において保存4。実際、酵母ベースのシステムは、一般的にユビキチン化機構の作用メカニズムを解読するために使用される。
生化学的手段によってタンパク質分解を研究することは、通常、細胞抽出物の調製を必要とします。動物細胞タンパク質、タンパク質相互作用及び機能を維持する比較的穏やかな条件下で抽出することができるが、酵母11ロバスト細胞壁の存在は、タンパク質の回収に影響を与える可能性がかなり厳しい破壊条件を必要とする。実際、酵母細胞破壊のための異なる手順が正しく、それらの相対的な細胞豊かさを表す量で完全なタンパク質を回復する能力がかなり異なる。さらに不正確さは特定のタンパク質の分解速度を決定するために使用されるメソッドの違いに固有のものである：イム続く代謝標識ベースの「パルスチェイス」実験munoprecipitation、特異的タンパク質12を単離するために、多くの場合、厳密に定量的ではない。タンパク質の分解は、この方法によって比較されたときにこのようにして、余分な注意が結果の解釈に注意すること。この欠点を回避するために、代替のシクロヘキシミド（CHX）追跡アッセイは、12を用いることができる。このアッセイでは、翻訳阻害剤は、細胞培養物に添加し、タンパク質の定常状態レベルの時間的変化は、続いてモニターされる。タンパク質合成の長期の阻害は、細胞傷害性であるようにもかかわらず、CHXの使用は、比較的短い半減期（<90分）を有するタンパク質に限定される。注目すべきことに、上記のアッセイの両方が常に利用可能でないタンパク質に特異的な抗体の使用を必要とする。
これらの技術的限界を克服するために、研究者は、細胞抽出と直接タンパク質の処理を必要としないいくつかのアプローチを開発しました。 1つのアプローチは栄養要求まことにの確立に基づいています必須の代謝酵素をコードする遺伝子の欠失によって得られる目株。このような遺伝子は、OMPデカルボキシラーゼをコードHIS3、LEU2、LYS2およびTRP1、アミノ酸生合成に必要な酵素のための符号化、並びにURA3（のUra3）、ピリミジンリボヌクレオチド生合成の重要な酵素が含まれる。 URA3広くタンパク質分解の研究で使用されている。これらのアッセイでは、のUra3の構成的発現は、ウラシル欠損培地中で13 URA3細胞の増殖を救出。その結果、デグロンの融合を通してのUra3を不安定するとウラシルを欠く最小培地で細胞増殖を減少させることができる。この方法は、劣化の識別を含む、様々なタンパク質分解研究で5決定基に使用されている、E3は14リガーゼ補助ユビキチンは15因子および新規UPSのデグロン16の発見。これらの方法の全ては、アッセイの読み出しとして、寒天プレート上の細胞増殖を用いた。ただし、tは彼の成長基準（ポジティブ/ネガティブの成長）、堅牢で効率的な、ほとんどが定性的であるとデグの効力または種々の補助劣化要因の相対的寄与を評価するために重要である定量的情報を提供していませんしながら。
そこで開発され、融合系-degron URA3によるタンパク質分解の体系的かつ定量的な分析を可能にする酵母ベクターおよびスクリーニング方法を利用している。プロトコルは、選択的条件下で液体培養物（GILS）および標準的な増殖曲線の生成に成長速度を測定扱いやすいアッセイに基づいている。ラグ、指数（対数）と固定相 – 酵母増殖動態は、3つの主要な相によって特徴づけられる。のUra3-デグロンの発現のレベルによって決定される選択条件下で対数期、中酵母複製動態の計算は、公平な定量的測定oをを提供fはタンパク質の分解。この方法は、複数の株に同時に複数のUPS基質の分解速度を測定し、比較することと、様々な条件の下で適用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、相対的な蛋白分解速度を決定するための細胞増殖に基づくアッセイを記載し、（GILS） '選択的条件下で液体培養での成長速度」と呼ばれる。 、これは、セットアップが簡単で、データ収集および解析は、簡単であり、それは非常にモジュール化されている：GILSアッセイは、いくつかの利点を有する。したがって、GILSハイスループットアプリケーションのための自動化に適応さ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Yuval Reiss and Dr. William Breuer for critically reviewing the manuscript and Omri Alfassy for helping in the development of the Ura3-GFP screen assay. We also thank Dr. M. Hochstrasser and Dr. R. Kulka for plasmids and strains. This work was funded by the Israeli Academy of Sciences (grant 786/08) and by the United States-Israel Binational Scientific foundation (grant 2011253).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Difco yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate | BD Biosciences | 233520 | For yeast growth on SD minimal media. Amino acids to be supplied are: Arginine, Histidine, Isoleucine, Leucine, Lysine, Methionine, Phenylalanine, Threonine, Tryptophan |
| Ammonium sulfate | Sigma – Aldrich | A4418 | |
| Glucose | Sigma – Aldrich | 16325 | |
| Adenine | Sigma – Aldrich | A8626 | |
| Uracil | Sigma – Aldrich | U0750 | |
| Amino acids | Highest purity available | ||
| 96 well plates | Nunc | 167008 | Any other compatible brand can be used |
| Cyclohexamide | Sigma – Aldrich | C7698 | Working conc. 0.5 mg/ml |
| Infinite 200 PRO series | Tecan | For yeast incubation and OD 600 measurements. Any other compatible temp-controled reader can be used | |
| MDTcalc | Experimental software |
Referências
- Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annual review of biochemistry. 67, 425-479 (1998).
- Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 679-689 (2008).
- Willems, A. R., et al. SCF ubiquitin protein ligases and phosphorylation-dependent proteolysis. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 354, 1533-1550 (1999).
- Tyers, M., Jorgensen, P. Proteolysis and the cell cycle: with this RING I do thee destroy. Curr Opin Genet Dev. 10, 54-64 (2000).
- Johnson, P. R., Swanson, R., Rakhilina, L., Hochstrasser, M. Degradation signal masking by heterodimerization of MATα2 and MAT a1 blocks their mutual destruction by the ubiquitin-proteasome pathway. Cell. 94, 217-227 (1998).
- Furth, N., et al. Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope. Molecular Biology of the Cell. 22, 4726-4739 (2011).
- Fredrickson, E. K., Gallagher, P. S., Clowes Candadai, S. V., Gardner, R. G. Substrate recognition in nuclear protein quality control degradation is governed by exposed hydrophobicity that correlates with aggregation and insolubility. J Biol Chem. 10, (2013).
- Rosenbaum, J. C., et al. Disorder Targets Misorder in Nuclear Quality Control A Disordered Ubiquitin Ligase Directly Recognizes Its Misfolded Substrates. Molecular cell. 41, 93-106 (2011).
- Ciechanover, A., Hod, Y., Hershko, A. A heat-stable polypeptide component of an ATP-dependent proteolytic system from reticulocytes. Biochemica., & Biophysical Research Communications. 81, 1100-1105 (1978).
- Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genética. 192, 319-360 (2012).
- Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. Cell wall construction in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 23, 185-202 (2006).
- Zhou, W., Ryan, J. J., Zhou, H. Global analyses of sumoylated proteins in Saccharomyces cerevisiae. Induction of protein sumoylation by cellular stresses. J Biol Chem. 279, 32262-32268 (2004).
- Alani, E., Kleckner, N. A new type of fusion analysis applicable to many organisms: protein fusions to the URA3 gene of yeast. Genética. 117, 5-12 (1987).
- Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation. Genes Dev. 15, 2660-2674 (2001).
- Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. EMBO J. 25, 533-543 (2006).
- Gilon, T., Chomsky, O., Kulka, R. G. Degradation signals for ubiquitin system proteolysis in Saccharomyces cerevisiae. Embo J. 17, 2759-2766 (1998).
- Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast 2 repressor. Cell. 61, 697-708 (1990).
- Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. J Biol Chem. 283, 32302-32316 (2008).
- Guthrie, C., Fink, G. R. . Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. 194, (1991).
- Carvalho, P., Goder, V., Rapoport, T. A. Distinct ubiquitin-ligase complexes define convergent pathways for the degradation of ER proteins. Cell. 126, 361-373 (2006).
- Denic, V., Quan, E. M., Weissman, J. S. A luminal surveillance complex that selects misfolded glycoproteins for ER-associated degradation. Cell. 126, 349-359 (2006).
- Wu, P. Y., et al. A conserved catalytic residue in the ubiquitin-conjugating enzyme family. Embo J. 22, 5241-5250 (2003).
- Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. 5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics. Methods Enzymol. 154, 164-175 (1987).
- Alfassy, O. S., Cohen, I., Reiss, Y., Tirosh, B., Ravid, T. Placing a disrupted degradation motif at the C terminus of proteasome substrates attenuates degradation without impairing ubiquitylation. J Biol Chem. 288, 12645-12653 (2013).
- Cronin, S. R., Hampton, R. Y. Measuring protein degradation with green fluorescent protein. Methods in Enzymology. 302, 58-73 (1999).
