단백질 분해의 체계적인 분석을위한 기자 기반의 성장 분석
Summary
Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.
Abstract
유비퀴틴 – 프로 테아 좀 시스템 (UPS)에 의한 단백질 분해는 모든 진핵 생물의 단백질 항상성의 주요 규제 메커니즘입니다. 세포 내 단백질 분해를 결정하는 표준 접근 방식은 단백질 감소의 반응 속도를 다음과 같은 사항에 대해 생화학 적 분석에 의존합니다. 이러한 방법은 종종 시간과 노력이 소요되고 여러 기판 및 분해 조건을 평가하기위한 실험을하는 것이 의무가 없습니다. 대안으로, 세포 성장 기반 분석은 정량적 단백질 수준에서의 상대적인 변화를 결정할 수있는 그들의 종래의 형식, 종점 분석법이다이 개발되고있다.
여기에서 우리는 충실하게 효모 세포 성장 속도론에 결합하여 단백질 분해 속도의 변화를 결정하는 방법을 설명합니다. 방법은 URA3의 우라실 영양 요구 효모 세포 외 인적으로 발현 리포터 단백질에 의해 구출 -deleted 확립 선택 시스템에 기초, 필수적인 URA3 유전자 및 열화 행렬식 (degron) 간의 융합 구성. 리포터 단백질의 분해 속도가 degron 의해 결정되는 반면 그 합성 속도가 일정하게되도록 설계된다. 우라실이 결핍 된 배지에서 세포 성장이 URA3의 상대적 수준에 비례하기 때문에, 성장 속도론은 리포터 단백질 분해에 전적으로 의존한다.
이 방법은 정확하게 세포 내 단백질 분해 반응 속도의 변화를 측정한다. (a) E2 효소 컨쥬 게이트 구조 – 기능 (c) 식별 및 신규 degrons의 특성을 분석하여 단백질 분해 (b)에 공지 유비퀴틴 공역 요인의 상대적 기여도를 평가 : 그것은 적용 하였다. 그것은 또한 다른 세포질 통로의 기능과 연관된 단백질 수준의 변화를 모니터링하도록 구성 될 수 degron- URA3 기반 시스템의 적용은, 단백질 분해 필드를 초월.
Introduction
유비퀴틴 – 프로 테아 분해 시스템은 모든 진핵 세포에서 단백질의 항상성 유지에 관여한다 주요 조절 시스템이다. UPS는 처음에 폴리 – 유비퀴틴 태그 단백질 26S 프로 테아 좀에 의해 분해 된 후, 표적 단백질에 여러 유비퀴틴 분자 공액. 대부분의 경우, 유비퀴틴 매개 된 분해에 대한 속도 제한 단계가 E2 효소 컨쥬 게이트 및 E3 효소 결찰에 의해 매개되는 기판 ubiquitylation (E3 리가 제) 1이다. 결과적으로, 특정 단백질의 세포 내 안정성은 유비퀴틴 접합 감수성과 동족 ubiquitylation 효소의 활성을 반영한다.
E3 리가 제는 UPS의 주요 기판 인식 구성 요소입니다. 따라서,이 효소가 없거나 자신의 안정적인 대응이 노출되지 중 하나 그들의 기판 내 degrons을 인식하고 있습니다. 세포주기 m의 예를 들면, 많은 레귤레이터UST 합성 순서 세포주기 진행을 유지하기 위해 시간적으로 특이 적으로 분해 될 수있다. 이러한 단백질의 분해는 종종 세포 시그널링 조절 키나아제에 의해 매개되는 3,4-, 인산화에 의해 제어된다. 반면에, 비정상적으로 접힌 단백질 애매한 degrons 통해 인식된다. 이들은 일반적으로 기본 구조에 숨겨진 구조의 교란에 노출되는 지역이다. 이러한 degrons 소수성 도메인 5-7과 본질적으로 무질서 세그먼트 (8)을 포함한다.
망상 적혈구 용 해물 (9)에서 단백질 분해 및 펀더멘털 특성화 유비퀴틴 시스템의 정액 발견 이래, 효모는 유전학 유비퀴틴 시스템 (10)의 많은 구성 요소를 발견하는 수단이되었다. UPS에 의한 단백질 분해에 대한 체계적인 분석 모델 생물로서 효모의 성공은 UPS가 높다는 사실에 주로 기인LY는 실험 시스템으로 그들의 복종 할 의무와 결합, 모든 진핵 생물 4 보존. 실제로, 효모 기반 시스템은 일반적으로 ubiquitylation 기계의 작용 메커니즘을 해독하기 위해 사용된다.
생화학 적 수단에 의한 단백질 분해를 공부하는 것은 일반적으로 세포 추출물의 준비가 필요합니다. 동물 세포 단백질 단백질 상호 작용 및 기능을 보존 비교적 온화한 조건에서 추출 될 수있는 반면, 효모 11 튼튼한 세포벽의 존재는 단백질의 복구에 영향을 미칠 수있는 붕괴 상당히 엄격한 조건이 필요하다. 실제로, 효모 세포 파괴에 대해 서로 다른 절차가 제대로 상대적인 세포 풍부을 나타내는 양 그대로 단백질을 복구하는 능력에 상당히 다릅니다. 또한 부정확 특정 단백질의 분해 속도를 결정하기 위해 사용되는 다양한 방법에 내재 : IM 다음 대사 라벨 기반의 '펄스 체이스'실험munoprecipitation, 특정 단백질 (12)을 분리, 자주 엄격하게 정량적 없습니다. 단백질 분해가이 방법에 의해 비교 될 때 따라서, 특별한주의는 결과를 해석에서 수행되어야한다. 이러한 결점을 회피하기 위해, 대안 사이클로 헥시 미드 (CHX) 체이스 분석은 (12)를 채용 할 수있다. 이 분석에서, 번역 억제제는 이후 모니터되는 세포 배양 및 단백질 정상 상태 수준의 시간 변화에 첨가된다. 그럼에도 불구하고, CHX의 사용은 비교적 짧은 반감기 (<90 분), 단백질 합성의 장기 억제 세포 독성 인 단백질로 한정한다. 특히, 상술 한 분석법 둘 항상 사용할 수없는 단백질 – 특이 적 항체의 사용을 필요로한다.
이러한 기술적 한계를 극복하기 위해, 연구자들은 세포 추출 및 직접 단백질 처리를 필요로하지 않는 여러 가지 방법을 개발했다. 하나의 접근법은 영양 요 참의 확립에 기초필수적인 대사 효소를 코딩하는 유전자의 결실에 의해 얻어진 세인트 균주. 이러한 유전자는 OMP 디카 르 복실 라제를 코딩 HIS3,는 Leu2, LYS2 및 TRP1, 아미노산 생합성에 필요한 효소 부호화뿐만 아니라 URA3 (URA3), 피리 미딘 리보 뉴클레오티드 생합성 필수적인 효소를 포함한다. URA3 광범위 단백질 분해 연구에서 사용되어왔다. 상기 분석에서, URA3의 구성 적 발현이 우라실 – 결핍 배지 13 URA3 세포의 성장을 구출. 따라서, degron의 융합을 통해 URA3를 불안정화하는 최소 배지에 우라실 결핍 세포의 성장을 감소시킬 수있다. 이 방법은 성능 저하의 식별을 포함하여 다양한 단백질 분해 연구에서 5 결정 사용되고, E3는 14 리가 및 보조 ubiquitylation 15 요인과 새로운 UPS의 degrons (16)의 발견. 이 모든 방법은 분석 판독 등의 한천 플레이트에 세포 성장을 고용했다. 그러나, t그 성장 조건 (양 / 음의 성장), 견고하고 효율적인 주로 질적이며 degron의 효능 또는 다양한 보조 열화 요인의 상대적 기여도를 평가하는 것이 중요하다 정량적 정보를 제공하지 않고있다.
따라서 우리는 개발 및 융합 시스템 -degron URA3에 의해 단백질 분해 체계적이고 정량적 인 분석을 가능하게 효모 벡터 및 심사 방법을 활용했다. 프로토콜은 선택적 조건 하에서 액체 배양 (GILS)과 표준 성장 곡선의 생성에 성장 동역학을 측정하기 쉬운 핸들 분석에 기초한다. 지연, 지수 (로그)과 정지상 – 효모 성장 속도론은 세 가지 주요 단계를 특징으로한다. URA3-degron의 발현의 수준에 의해 결정되는 조건 하에서 선택적 로그 단계 동안 효모 복제 동력학 계산, 공평 정량적 측정을 제공 오F 단백질 분해. 이 방법은 측정하고 동시에 다수의 변형 및 다양한 조건 하에서 여러 UPS 기판의 분해율을 비교에 적용될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서 우리는 (GILS) '선택적 조건에서 액체 배양에서 성장 속도론'라고 상대 단백질 분해 속도를 결정하는 세포의 성장을 기반으로 분석을 설명합니다. 그것은 설정하는 간단한 데이터 수집 및 분석은 간단하고 매우 모듈 형 : GILS 분석은 몇 가지 장점이 있습니다. 따라서, 높은 처리량 GILS 애플리케이션을위한 자동화하도록 적응 될 수있는 사용자 친화적 인 멀티 웰 플레이트 형식으로 여…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Yuval Reiss and Dr. William Breuer for critically reviewing the manuscript and Omri Alfassy for helping in the development of the Ura3-GFP screen assay. We also thank Dr. M. Hochstrasser and Dr. R. Kulka for plasmids and strains. This work was funded by the Israeli Academy of Sciences (grant 786/08) and by the United States-Israel Binational Scientific foundation (grant 2011253).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Difco yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate | BD Biosciences | 233520 | For yeast growth on SD minimal media. Amino acids to be supplied are: Arginine, Histidine, Isoleucine, Leucine, Lysine, Methionine, Phenylalanine, Threonine, Tryptophan |
| Ammonium sulfate | Sigma – Aldrich | A4418 | |
| Glucose | Sigma – Aldrich | 16325 | |
| Adenine | Sigma – Aldrich | A8626 | |
| Uracil | Sigma – Aldrich | U0750 | |
| Amino acids | Highest purity available | ||
| 96 well plates | Nunc | 167008 | Any other compatible brand can be used |
| Cyclohexamide | Sigma – Aldrich | C7698 | Working conc. 0.5 mg/ml |
| Infinite 200 PRO series | Tecan | For yeast incubation and OD 600 measurements. Any other compatible temp-controled reader can be used | |
| MDTcalc | Experimental software |
Referências
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