Baseada Reporter ensaio de crescimento para análise sistemática de degradação de proteínas

Summary

Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

Abstract

A degradação das proteínas pelo sistema ubiquitina-proteassoma (UPS) é um importante mecanismo de regulação para a homeostase da proteína em todos os eucariotas. A abordagem padrão para determinar a degradação da proteína intracelular se baseia em ensaios bioquímicos para seguir a cinética de declínio proteína. Tais métodos são frequentemente trabalhoso e demorado e, portanto, não passível de experiências destinadas a avaliar múltiplos substratos e as condições de degradação. Como alternativa, ensaios baseados em células de crescimento têm sido desenvolvidos, que são, no seu formato convencional, ensaios de ponto final, que não é possível determinar quantitativamente as mudanças relativas nos níveis de proteína.

Aqui, descrevemos um método que determina fielmente as alterações nas taxas de degradação de proteínas por acoplamento los a uma cinética de crescimento de levedura célula. O método é baseado em um sistema de seleção estabelecido em uracila Auxotrofia de URA3 -deleted células de levedura é resgatado por uma proteína repórter exogenamente expressa, Composta de uma fusão entre o gene URA3 essencial e determinante degradação (degron). A proteína repórter é concebido de modo a que a sua taxa de síntese é constante enquanto que a sua taxa de degradação é determinada pela degron. Como o crescimento celular em meio deficiente em uracilo-é proporcional aos níveis relativos de Ura3, cinética de crescimento são inteiramente dependentes da degradação da proteína repórter.

Este método mede com precisão mudanças na cinética de degradação de proteínas intracelulares. Aplicou-se a: (a) Avaliação da contribuição relativa dos factores de conjugação de ubiquitina conhecidos à proteólise (b) E2 enzima de conjugação de estrutura-função de análises (c) Identificação e caracterização de novos degrons. A aplicação do sistema baseado URA3 degron- transcende o campo de degradação de proteínas, como pode também ser adaptada para a monitorização das alterações dos níveis de proteína associados com as funções de outras vias celulares.

Introduction

O sistema de degradação da ubiquitina-proteassoma é um importante regulador da máquina, que tem sido implicado na manutenção da homeostase da proteína em todos os eucariotas. A UPS inicialmente conjuga múltiplas moléculas de ubiquitina a uma proteína-alvo, após o que a proteína poli-ubiquitina-marcado é degradado pelo proteassoma 26S. Na maioria dos casos, o passo limitante da velocidade para a degradação mediada por ubiquitina é ubiquitinação substrato, mediada por E2 e E3 conjugar enzimas ligando enzimas (ligases E3) ^1. Por conseguinte, a estabilidade intracelular de proteínas específicas reflecte a sua susceptibilidade a ubiquitina-conjugação e a actividade das suas enzimas cognatas ubiquitinação.

E3 ligases são os componentes de reconhecimento de substrato principais da UPS. Como tal, estas enzimas reconhecem degrons dentro de seus substratos que estão ausentes ou não expostos em suas contrapartes estáveis ^​​2. Por exemplo, muitos reguladores do ciclo celular must ser sintetizado e degradado de uma forma temporal específica, a fim de manter a progressão do ciclo celular em ordem. A degradação destas proteínas é muitas vezes controlada pela fosforilação, mediadas por quinases de sinalização celulares regulados ^3,4. Por outro lado, as proteínas anormalmente dobradas são reconhecidos através degrons enigmáticas. Estas são as regiões que normalmente são escondidos na estrutura nativa e estão expostos em cima estrutura perturbação. Tais degrons incluem domínios hidrófobos e segmentos de ^5-7 intrinsecamente desordenados ^8.

Desde a descoberta seminal do sistema ubiquitina-proteína para degradação e a caracterização dos seus fundamentos em lisados ​​de reticulócitos de ^9, genética de leveduras foi instrumental na descoberta de muitos dos componentes do sistema ubiquitina ^10. O sucesso da levedura como organismo modelo para a análise sistemática da degradação das proteínas pelo UPS é principalmente devido ao fato de que o UPS é altaly conservada em todos os eucariontes ^4, juntamente com a sua receptividade como um sistema experimental. De facto, os sistemas à base de levedura são vulgarmente utilizados para decifrar os mecanismos de acção da máquina ubiquitinação.

Estudando a degradação da proteína por meios bioquímicos normalmente requer uma preparação de extractos celulares. Enquanto proteínas da célula animal pode ser extraída sob condições relativamente suaves que preservem as interacções e função de proteínas, a presença de uma parede celular de levedura ¹¹ robusto no requer consideravelmente mais severas condições de perturbação, que podem afectar a recuperação de proteína. De fato, diferentes procedimentos de levedura rompimento celular variam consideravelmente em sua capacidade para recuperar proteínas intactas em quantidades que representem corretamente a sua abundância relativa celular. Além disso imprecisão é inerente aos diferentes métodos empregados para a determinação das taxas de degradação de proteínas específicas: experimentos metabólicos à base de rotulagem 'pulse-chase' seguido de immunoprecipitation, para isolar proteínas específicas ^12, muitas vezes não é estritamente quantitativa. Assim, quando a degradação da proteína é comparada por este método, cuidado extra deve ser tomado na interpretação dos resultados. Para contornar este inconveniente, um ensaio perseguição cicloheximida alternativa (CHX) podem ser empregados ^12. Neste ensaio, o inibidor da tradução é adicionado a culturas de células e alterações temporais nos níveis em estado estacionário da proteína são subsequentemente monitorizados. No entanto, o uso de CHX está limitado às proteínas com semi-vidas relativamente curtas (<90 min), como a inibição de longa duração da síntese de proteínas é citotóxica. Notavelmente, ambos os ensaios mencionados acima requerem a utilização de anticorpos específicos para a proteína, o que nem sempre estão disponíveis.

Para superar estas limitações técnicas, os investigadores têm desenvolvido vários métodos que não requerem a extracção de células e proteínas manuseamento directo. Uma abordagem baseia-se no estabelecimento de sim auxotróficoestirpes st, obtidos por deleção dos genes que codificam enzimas metabólicas essenciais. Tais genes incluem HIS3, LEU2, LYS2 e TRP1, que codifica para as enzimas necessárias para a biosíntese de aminoácidos, bem como URA3 que codifica OMP-descarboxilase (Ura3), uma enzima essencial da pirimidina ribonucleótido biossíntese. Ura3 tem sido amplamente utilizado em estudos de degradação de proteínas. Nestes ensaios, a expressão constitutiva de Ura3 resgata o crescimento de células ura3 em meio deficiente em ^uracilo-13. Consequentemente, desestabilizando Ura3 através da fusão de um degron pode diminuir o crescimento das células em meio mínimo sem uracilo. Este método tem sido utilizado em vários estudos de degradação de proteínas, incluindo a identificação dos determinantes da degradação ^{5, 14} e ligases E3 ubiquitinação auxiliar factores ¹⁵ e a descoberta de novos UPS degrons ^16. Todos estes métodos empregues crescimento celular em placas de agar como o ensaio de leitura. No entanto, tele critério de crescimento (crescimento positivo / negativo), enquanto robusto e eficiente, é principalmente qualitativa e não fornece informação quantitativa que é importante para avaliar a potência de um degron ou a contribuição relativa dos diversos fatores de degradação auxiliares.

Temos, portanto, desenvolvidos e utilizados vetores de levedura e métodos de rastreio que permite uma análise sistemática e quantitativa da degradação de proteínas pela URA3 -degron sistema de fusão. O protocolo baseia-se em um ensaio de manusear fácil que mede a cinética do crescimento na cultura líquido sob condições selectivas (gils) e na geração de curvas de crescimento padrão. Cinética de crescimento de levedura são caracterizados por três fases principais – o atraso, o exponencial (log) e da fase estacionária. Cálculo da cinética de replicação de levedura durante a fase log em condições selectivas, que é determinada pelos níveis de expressão do Ura3-degron, fornece uma medição imparcial o quantitativof degradação da proteína. Este método pode ser aplicado para medir e comparar as taxas de degradação de vários substratos UPS simultaneamente em múltiplas linhagens e sob várias condições.

Protocol

1. Cultura celular Transformar as células de levedura auxotróficos, adequados, tais como Try467 (Tabela 2), com um plasmídeo contendo (a) um URA3 -degron de fusão e (b) um marcador de selecção adicional para metabólica plasmídeo e manutenção. NOTA: Um exemplo de um plasmídeo adequado é YDpK-MET25p-Deg1-FLAG-Vma12-Ura3 (LYS2) (Deg1- UV) Este é um plasmídeo integrativo de levedura contendo uma proteína de fusão que compreende de Deg1 – degron um…

Representative Results

Investigar o papel das enzimas da via Doa10 na degradação de um substrato de repórter Para testar a validade do método gils que foi comparado com um ensaio de degradação de tradicional. Esta experiência avalia a contribuição relativa dos componentes da membrana localizada ER-Doa10-ligase E3 complexo de 20,21 para a degradação do substrato de proteína repórter de controlo de qualidade Deg1- VU (Figura 3A). O plasmídeo Deg…

Discussion

Aqui nós descrevemos um ensaio baseado no crescimento celular para determinar a taxa de degradação da proteína relativos, denominado 'A cinética do crescimento em cultura líquida sob condições selectivas "(Gils). O ensaio Gils tem várias vantagens: é simples de configurar, aquisição e análise de dados é simples e é extremamente modular. Consequentemente, Gils podem ser aplicadas simultaneamente para várias amostras em um amistoso formato de placa de multi-usuário que também pode ser adaptado a…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Difco yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate	BD Biosciences	233520	For yeast growth on SD minimal media.  Amino acids to be supplied are: Arginine, Histidine, Isoleucine, Leucine, Lysine, Methionine, Phenylalanine, Threonine, Tryptophan
Ammonium sulfate	Sigma – Aldrich	A4418
Glucose	Sigma – Aldrich	16325
Adenine	Sigma – Aldrich	A8626
Uracil	Sigma – Aldrich	U0750
Amino acids	Highest purity available
96 well plates	Nunc	167008	Any other compatible brand can be used
Cyclohexamide	Sigma – Aldrich	C7698	Working conc. 0.5 mg/ml
Infinite 200 PRO series	Tecan		For yeast incubation and OD 600 measurements. Any other compatible temp-controled reader can be used
MDTcalc			Experimental software