Репортер основе анализа роста для систематического анализа белка деградации
Summary
Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.
Abstract
Деградация белков в убикитина-протеасомного системы (UPS) является одним из основных нормативно механизм белкового гомеостаза во всех эукариот. Стандартный подход к определению деградации внутриклеточного белка зависит от биохимических анализов для следующих кинетику спада белка. Такие методы часто трудоемкий и занимает много времени, и, следовательно, не поддается экспериментов, направленных на оценку нескольких подложек и условий деградации. В качестве альтернативы, на основе роста клеток анализы были разработаны, которые являются, в их традиционном формате, конечных точек анализов, которые не могут количественно определяют относительные изменения уровня белка.
Здесь мы опишем метод, который верой и правдой определяет изменения в скоростях разложения белковых сочетанием их кинетики клеточного роста дрожжей. Метод основан на установленной системой отбора, где урацил ауксотрофию URA3 -deleted дрожжевые клетки спасает экзогенно выраженной репортера белка, Состоит из слияния между основного гена URA3 и деградации определителя (degron). Репортерный белок устроен так, что его скорость синтеза является постоянным, пока его скорость разложения определяется degron. Как рост клеток в урацил-дефицитных среде пропорциональна относительных уровней URA3, кинетика роста являются полностью зависит от деградации белка репортер.
Этот метод точно измеряет изменения в внутриклеточных кинетики деградации белка. Она была применена к: (а) оценка относительного вклада известных убиквитиновых сопрягающих факторов на протеолиз (б) E2 конъюгации фермент структура-функция анализирует (с) идентификация и характеристика новых degrons. Применение degron- URA3 -based системы превосходит поле деградации белка, как он также может быть выполнен с возможностью мониторинга изменений уровней белка, связанных с функциями других клеточных путей.
Introduction
Система деградации убиквитин-протеасомный является одним из основных нормативно-машина, которая участвует в поддержании гомеостаза белка во всех эукариот. ИБП изначально сопрягает несколько молекул убиквитин для белка-мишени, после чего поли-убикитина-меченый белок разлагается протеасомой 26S. В большинстве случаев, скорость шаг для убиквитин опосредованной деградации ограничение является субстратом убиквитилирование, опосредовано Е2 конъюгации ферменты и ферменты Е3 лигирования (E3 Лигазы) 1. Следовательно, внутриклеточная стабильность специфических белков отражает их восприимчивость к убиквитиновой-сопряжения и активность их родственными Ubiquitylation ферментов.
E3 лигазы являются основными компонентами распознавания субстрата из ИБП. Как таковые, эти ферменты признать degrons в пределах их субстратов, которые либо отсутствуют, либо не подвергались в их стабильных аналогов 2. Например, многие регуляторы клеточного цикла мУсть быть синтезированы и разложению, в результате временно определенным образом, чтобы поддерживать прогрессию клеточного цикла в порядке. Деградация этих белков часто контролируется путем фосфорилирования, опосредовано клеточных сигнальных регулируемых киназ 3,4. С другой стороны, аномально-сложенные белки распознаются через загадочные degrons. Это регионы, которые обычно скрыты в нативной структуры и подвергаются на структуры возмущения. Такие degrons включают гидрофобные домены 5-7 и внутренне неупорядоченные сегменты 8.
Так как семенной открытие убиквитин-системы для деградации белка и характеризации его основ в лизатах ретикулоцитов 9, дрожжевые генетика способствовал в раскрытии многие из компонентов системы убиквитин 10. Успех дрожжей в качестве модельного организма для систематического анализа деградации белков ИБП, в основном за счет того, что ИБП является высокимлы сохраняется во всех эукариот 4, в сочетании с их аменабельности как экспериментальной системы. Действительно, системы дрожжей на основе обычно используются, чтобы расшифровать механизмы действия Ubiquitylation машин.
Изучение деградации белка биохимических средств, как правило, требуется подготовка клеточных экстрактов. В то время как животное клеточные белки могут быть извлечены в относительно мягких условиях, которые сохраняют белковых взаимодействий и функцию, наличие надежной клеточной стенки в дрожжах 11 требует значительно более жестких условий срыва которые могут повлиять на восстановление белка. Действительно, различные процедуры, связанные с нарушением дрожжевой клетки значительно различаются по своей способности к восстановлению интактные белки в количествах, которые правильно представляют их относительную клеточную изобилие. Далее неточность присуща различных методов, используемых для определения деградации ставки специфических белков: Метаболические маркировке на основе "Импульс-погони" эксперименты с последующим имmunoprecipitation, чтобы изолировать специфические белки 12, часто не строго количественный. Таким образом, когда деградация белка по сравнению с этим методом, дополнительная осторожность следует проявлять при интерпретации результатов. Чтобы обойти этот недостаток, альтернатива циклогексимид (СНХ) погоня анализ может быть использован 12. В этом анализе, ингибитор перевод будет добавлен в клеточных культурах и временных изменений в уровнях белка стационарных впоследствии контролироваться. Тем не менее, использование хлоргексидином ограничивается белков с относительно коротким периодом полураспада (<90 мин), как долгосрочное подавление синтеза белка цитотоксичен. Следует отметить, что оба вышеуказанных анализов требуют использования белковых-специфических антител, которые не всегда доступны.
Чтобы преодолеть эти технические ограничения, исследователи разработали несколько подходов, которые не требуют извлечения клеток и прямой обработки белка. Один подход основан на создании ауксотрофного Yeaштаммы й, полученные путем делеции генов, кодирующих важные метаболические ферменты. Такие гены включают HIS3, LEU2, TRP1 и Lys2, кодирование для ферментов, необходимых для биосинтеза аминокислот, а также URA3, который кодирует OMP декарбоксилазы (URA3), существенную фермент биосинтеза пиримидина рибонуклеотидной. URA3 широко используется в деградации белков исследований. В этих анализах, конститутивной экспрессии URA3 спасает рост клеток URA3 в урацил-дефицитных среды 13. Следовательно, дестабилизации URA3 путем слияния с degron может уменьшить рост клеток на минимальной среде без урацила. Этот метод был использован в различных исследованиях деградации белка, в том числе определение деградации детерминанты 5, E3 лигаз 14 и вспомогательный убиквитилирование факторы 15 и открытие новых ИБП degrons 16. Все эти методы используются рост клеток на чашках с агаром, как для анализа считывания. Тем не менее, тон критерий роста (положительный / отрицательный рост), в то время как надежный и эффективный, в основном качественный и не обеспечивает количественную информацию, которая важна для оценки потенции degron или относительный вклад различных вспомогательных факторов деградации.
Поэтому мы разработали и использовали дрожжевые векторы и методы скрининга позволяет систематическое и количественный анализ деградации белков в URA3 -degron системы синтеза. Протокол основан на простой в обращении анализа, который измеряет кинетики роста в жидкой культуре в условиях селективной (GILS) и по генерации стандартных кривых роста. Кинетика роста дрожжей характеризуются три основных этапа – отставание, экспоненциальный (лог) и неподвижной фазы. Расчет кинетики дрожжи репликации на этапе журнала в селективных условиях, которая определяется уровнями экспрессии URA3-degron, обеспечивает объективную количественную измерения уродеградация белков е. Этот метод может быть применен к измерения и сравнения темпы деградации нескольких подложек ИБП одновременно в нескольких штаммов и при различных условиях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы опишем анализа, основанного на рост клеток для определения относительных скоростей деградации белка, называемого «Кинетика роста в жидкой культуре в условиях селективной» (GILS). GILS анализ имеет ряд преимуществ: это простой в настройке, сбора и анализа данных проста и крайне мод…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Yuval Reiss and Dr. William Breuer for critically reviewing the manuscript and Omri Alfassy for helping in the development of the Ura3-GFP screen assay. We also thank Dr. M. Hochstrasser and Dr. R. Kulka for plasmids and strains. This work was funded by the Israeli Academy of Sciences (grant 786/08) and by the United States-Israel Binational Scientific foundation (grant 2011253).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Difco yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate | BD Biosciences | 233520 | For yeast growth on SD minimal media. Amino acids to be supplied are: Arginine, Histidine, Isoleucine, Leucine, Lysine, Methionine, Phenylalanine, Threonine, Tryptophan |
| Ammonium sulfate | Sigma – Aldrich | A4418 | |
| Glucose | Sigma – Aldrich | 16325 | |
| Adenine | Sigma – Aldrich | A8626 | |
| Uracil | Sigma – Aldrich | U0750 | |
| Amino acids | Highest purity available | ||
| 96 well plates | Nunc | 167008 | Any other compatible brand can be used |
| Cyclohexamide | Sigma – Aldrich | C7698 | Working conc. 0.5 mg/ml |
| Infinite 200 PRO series | Tecan | For yeast incubation and OD 600 measurements. Any other compatible temp-controled reader can be used | |
| MDTcalc | Experimental software |
Referências
- Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annual review of biochemistry. 67, 425-479 (1998).
- Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 679-689 (2008).
- Willems, A. R., et al. SCF ubiquitin protein ligases and phosphorylation-dependent proteolysis. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 354, 1533-1550 (1999).
- Tyers, M., Jorgensen, P. Proteolysis and the cell cycle: with this RING I do thee destroy. Curr Opin Genet Dev. 10, 54-64 (2000).
- Johnson, P. R., Swanson, R., Rakhilina, L., Hochstrasser, M. Degradation signal masking by heterodimerization of MATα2 and MAT a1 blocks their mutual destruction by the ubiquitin-proteasome pathway. Cell. 94, 217-227 (1998).
- Furth, N., et al. Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope. Molecular Biology of the Cell. 22, 4726-4739 (2011).
- Fredrickson, E. K., Gallagher, P. S., Clowes Candadai, S. V., Gardner, R. G. Substrate recognition in nuclear protein quality control degradation is governed by exposed hydrophobicity that correlates with aggregation and insolubility. J Biol Chem. 10, (2013).
- Rosenbaum, J. C., et al. Disorder Targets Misorder in Nuclear Quality Control A Disordered Ubiquitin Ligase Directly Recognizes Its Misfolded Substrates. Molecular cell. 41, 93-106 (2011).
- Ciechanover, A., Hod, Y., Hershko, A. A heat-stable polypeptide component of an ATP-dependent proteolytic system from reticulocytes. Biochemica., & Biophysical Research Communications. 81, 1100-1105 (1978).
- Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genética. 192, 319-360 (2012).
- Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. Cell wall construction in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 23, 185-202 (2006).
- Zhou, W., Ryan, J. J., Zhou, H. Global analyses of sumoylated proteins in Saccharomyces cerevisiae. Induction of protein sumoylation by cellular stresses. J Biol Chem. 279, 32262-32268 (2004).
- Alani, E., Kleckner, N. A new type of fusion analysis applicable to many organisms: protein fusions to the URA3 gene of yeast. Genética. 117, 5-12 (1987).
- Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation. Genes Dev. 15, 2660-2674 (2001).
- Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. EMBO J. 25, 533-543 (2006).
- Gilon, T., Chomsky, O., Kulka, R. G. Degradation signals for ubiquitin system proteolysis in Saccharomyces cerevisiae. Embo J. 17, 2759-2766 (1998).
- Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast 2 repressor. Cell. 61, 697-708 (1990).
- Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. J Biol Chem. 283, 32302-32316 (2008).
- Guthrie, C., Fink, G. R. . Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. 194, (1991).
- Carvalho, P., Goder, V., Rapoport, T. A. Distinct ubiquitin-ligase complexes define convergent pathways for the degradation of ER proteins. Cell. 126, 361-373 (2006).
- Denic, V., Quan, E. M., Weissman, J. S. A luminal surveillance complex that selects misfolded glycoproteins for ER-associated degradation. Cell. 126, 349-359 (2006).
- Wu, P. Y., et al. A conserved catalytic residue in the ubiquitin-conjugating enzyme family. Embo J. 22, 5241-5250 (2003).
- Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. 5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics. Methods Enzymol. 154, 164-175 (1987).
- Alfassy, O. S., Cohen, I., Reiss, Y., Tirosh, B., Ravid, T. Placing a disrupted degradation motif at the C terminus of proteasome substrates attenuates degradation without impairing ubiquitylation. J Biol Chem. 288, 12645-12653 (2013).
- Cronin, S. R., Hampton, R. Y. Measuring protein degradation with green fluorescent protein. Methods in Enzymology. 302, 58-73 (1999).
