Die Analyse der neurovaskuläre Remodeling in Entorhino-Hippocampus Organotypischen Kulturen

Summary

Ein Protokoll für entorhino-Hippocampus organotypischen Kulturen, die Wiedergabe von vielen Aspekten der ischämischen Hirnschädigung ermöglicht, wird vorgestellt. Durch das Studium der Veränderungen der Leitungsbahnen in Zusätzlich zu den Veränderungen in den Nervenzellen ist dieses Protokoll ein vielseitiges Werkzeug, um plastische Veränderungen im Nervengewebe nach Verletzungen zu studieren.

Abstract

Ischämischen Hirnverletzung ist eine der häufigsten und schwersten Bedingungen Kompromisse ordnungsgemäße Funktion des Gehirns und führt zu anhaltenden funktionellen Defiziten in den betroffenen Patienten oft. Trotz intensiver Forschungsanstrengungen, gibt es noch keine wirksame Behandlungsmethode verfügbar, die neuronale Verletzung reduziert und schützt Neuronen in den ischämischen Bereichen von verzögerten Sekundär Tod. Forschung in diesem Bereich umfasst typischerweise die Verwendung von aufwendigen und problematischen Tiermodellen. Entorhino-Hippocampus organotypischen Kulturen mit Sauerstoff und Glukose Deprivation (OGD) in Frage gestellt werden in vitro Modelle, die zerebrale Ischämie imitieren etabliert. Der neuartige Aspekt der vorliegenden Studie ist, dass Veränderungen der Gehirnblutgefäße neben neuronalen Veränderungen und die Reaktion sowohl des neuronalen Raum und dem vaskulären Kompartiment untersucht verglichen und korreliert werden. Die in diesem Protokoll vorgestellten Verfahren die möglichen Anwendungen der wesentlichen verbreitern oderganotypic Schnittkultur-Ansatz. Die Induktion der OGD oder Hypoxie allein durch relativ einfache Mittel in organotypischen Kulturen angewendet werden und führt zu einer zuverlässigen und reproduzierbaren Schäden im Nervengewebe. Dies steht in krassem Gegensatz zu den komplizierten und problematischen Tierversuche Induktion Schlaganfall und Ischämie in vivo. Durch die Erweiterung der Analyse auf die Untersuchung der Reaktion des Gefäßsystems könnten neue Möglichkeiten auf, wie die Erhaltung und Wiederherstellung Hirnfunktionen bereitzustellen. Die Schnittkultur hier vorgestellte Ansatz könnte zu einem attraktiven und wichtigen Werkzeug für die Untersuchung der ischämischen Hirnschädigung entwickeln und könnte nützlich für die Prüfung potenzieller therapeutischer Maßnahmen auf die Neuroprotektion angestrebt werden.

Introduction

Das Zentralnervensystem ist besonders empfindlich gegenüber einem Verlust oder Reduktion von Sauerstoff und Glucose durch die Gefäßversorgung. Selbst eine eher kurze Unterbrechung der Blutversorgung des Gehirns kann einen dauerhaften Verlust der Funktion der jeweiligen Hirngebiete, die zu den typischen Hub-Syndrome zu induzieren. Zusätzlich zu dem Verlust von Nervenzellen in den primären betroffenen Gebieten gibt es typischerweise zusätzliche verzögerten neuronalen Verlust durch Sekundärschäden. Leider bis jetzt keine neuroprotektive Behandlung zur Verringerung von Sekundär neuronalen Tod verfügbar war ^1. Forschungsanstrengungen zur Untersuchung der Mechanismen der Sekundärschäden auf der Verwendung von Tiermodellen der zerebralen Ischämie wie mittleren Hirnarterie Okklusion und verschiedenen thrombotischen Verschluss Techniken beruhen (eine aktuelle Übersicht siehe ^2). Parallel auch aufgrund von Einschränkungen und ethische Bedenken bei der Verwendung von Tiermodellen, organotypischen Kultur der verschiedenen ZNS-Gewebe verwendet wurden, die die stu ermöglichendy der neuronalen Reaktionen auf verschiedene Art der Verletzungen ^3-5.

Für die Untersuchung der neuronalen Reaktion unter Bedingungen, die ischämische Gehirnverletzung zu imitieren, ist das Modellsystem von Sauerstoff Glukose Deprivation (OGD) entwickelt. In diesem Modell werden die Schnittkulturen vorübergehend auf einem Medium, das Glucose mangelt und wurde mit Stickstoffgas in der Abwesenheit von Sauerstoff ausgesetzt, äquilibriert worden. Bei einer solchen Behandlung ist es möglich, neuronaler Verletzung und der Verlust der eher ähnlich dem nach ischämischer Verletzung in vivo ^{6, 7} beobachtet induzieren. Im Hippocampus, induziert eine derartige Behandlung neuronaler Verluste insbesondere in der CA1, aber nicht in der CA3-Bereich oder dem Gyrus dentatus des Hippocampus. Im Gegensatz dazu ist die Untersuchung des vaskulären Reaktionen in Schnittkulturen bisher nicht weit verbreitet durchgeführt. Ein offensichtlicher Grund ist der Mangel an Durchblutung und Gefäßdurchblutung in der Schnittkultur-Modell. Allerdings haben wir früher gezeigt haben, dass es möglich ist, b zu erhaltenlood Gefäße im ZNS Schnittkulturen für mehrere Tage ^{8, 9.}

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist, um das Schicksal von Neuronen nach OGD nicht nur überwachen, sondern erstrecken sich die Studie mit dem Schicksal und den Umbau des Gefäßsystems, die ein wichtiger Teil der Schädigung Antwort ist. Bis jetzt solche Studien haben die Verwendung von Tierversuchen erforderlich (. De Jong et al, 1999; Cavaglia et al., 2001). In der hier vorgestellten Protokoll, werden wir detailliert, wie solche Studien können in entorhino-Hippocampus organotypischen Kulturen getan werden herausgefordert, entweder mit Hypoxie oder durch exzitotoxische Läsionen gefolgt von der Analyse der beiden neuronalen Überleben und Blutgefäßreaktionen. Dieses Protokoll basiert auf einer zuvor veröffentlichten Studie zu diesem Thema ¹⁰ und kann nützlich für jedes Labor interessiert neurovaskulären Wechselwirkungen im ZNS sein.

Protocol

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit der EG-Richtlinie vom 22. September 2010 des Rates durchgeführt (2010/63 / EU) und wurden überprüft und durch die Schweizer Behörden zugelassen. 1. Einrichten Organotypische Entorhino-Hippocampus-Schnittkulturen Bereiten entorhino-Hippocampus organotypischen Kulturen (EHOSCs) von postnatalen Tag 4 (P4) Maus Welpen mit der statischen Methode Inkubation 4,11. Hier verwenden C57Bl6 und CB6F1 Mäusen. Nehmen Sie etwa …

Representative Results

Sauerstoff Glukose Deprivation und Hypoxie induzieren neuronalen Tod und Gefäßreduktion insbesondere im Hippocampus CA1-Region. OGD oder Sauerstoffentzug allein für 15 Minuten führte zu einer starken Induktion von Zelltod durch Propidiumiodid-Färbung spezifisch in der CA1-Region des Hippocampus (Figur 3) gesehen, ähnlich wie zuvor beschrieben 7. Mit den Markierungen von Blutgefässen zu visualisieren, wurde festgestellt, dass der Blutgefäßdichte und Organisation erschi…

Discussion

Mit den hier vorgestellten Methoden kann Hippocampus organotypischen Schnittkulturen als vielseitiges Werkzeug zur plastischen Veränderungen im Nervengewebe nach Verletzungen zu untersuchen. Während organotypischen Kulturen haben in der Vergangenheit für die Untersuchung der neuronalen Reaktionen nach Ischämie ^{6, 7} der neuen Aspekt der gleichzeitigen Untersuchung von Gefäßveränderungen verwendet wurde erheblich erweitert die Anwendungsmöglichkeiten dieser Methode. Die Induktion der OGD oder Hypoxie al…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Minimum Essential Medium MEM	Gibco	11012-044
Glutamax	Gibco	35050-061	stabilized form of L-glutamine
Millicell cell culture inserts	Millipore	PICM03050
Basal medium Eagle	Gibco	41010-026
Horse serum	Gibco	26050-088
Neurobasal medium	Gibco	21103-049
B27 supplement	Gibco	17504-044
Anaerobic strips	Sigma-Aldrich	59886
Propidium iodide solution	Sigma-Aldrich	P4864
AMPA	R&D systems	0169-10
CNQX	R&D systems	0190/10
TTX	R&D systems	1078/1
polyclonal anti-laminin	Sigma-Aldrich	L9393
anti-MAP2	Abcam	ab11267
Alexa anti mouse 350	Molecular Probes	A11045
Alexa anti mouse 488	Molecular Probes	A11001
Alexa anti rabbit 350	Molecular Probes	A11046
Alexa anti rabbit 488	Molecular Probes	A11008
Statistics software	GraphPad Software	GraphPad Prism
McIlwain tissue chopper	Ted Pella	10180
Hypoxia chamber	Billups-Rothenberg	MIC-101