Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein’s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.
Zentrosomen sind kleine, aber wichtige Organellen, wie die Pole der mitotischen Spindel, um genomische Integrität aufrecht zu erhalten oder zu montieren primären Zilien der Sinnesfunktionen in Zellen zu erleichtern dienen. Der Pegel eines Proteins kann unterschiedlich an Zentrosomen als an anderen Orten .cellular reguliert werden, und die Variation in der zentrosomalen Pegel mehrerer Proteine an unterschiedlichen Punkten des Zellzyklus scheint für die richtige Regulierung der centriole Anordnung sein. Wir entwickelten eine quantitative Fluoreszenzmikroskopie Assay, der relativen Änderungen der Pegel eines Proteins an Zentrosomen in fixierten Zellen aus verschiedenen Proben, wie in den verschiedenen Phasen des Zellzyklus oder nach der Behandlung mit verschiedenen Reagenzien misst. Das Prinzip dieses Tests besteht in der Messung der korrigierte Hintergrundfluoreszenzintensität, die ein Protein in einem kleinen Bereich, und zu normalisieren, dass die Messung an der gleichen für ein anderes Protein, das nicht unter den gewählten Versuchs c nicht ändertondition. Unter Verwendung dieses Assays in Kombination mit BrdU Impuls und chase Strategie zur ungestörten Zellzyklen zu untersuchen, haben wir quantitativ durch Proteasom-vermittelten Abbau speziell an Zentrosomen validiert unserer jüngsten Beobachtung, daß die zentrosomalen Pool von VDAC3 an Zentrosomen während des Zellzyklus reguliert wird, wahrscheinlich.
Zentrosomen bestehen aus einem Paar von Centriolen pericentriolar Material (PCM) umgeben ist. Als die großen Mikrotubuli-Organisationszentren (MTOCs) in Säugerzellen dienen Zentrosomen als die beiden Pole der mitotischen Spindel in sich teilenden Zellen, und damit zur Erhaltung der genomischen Integrität ein. In ruhenden Zellen (zB während G0-Phase), einer der beiden Centriolen der Zentrosomen, nämlich die Mutter centriole, wird in eine Basaltemperatur transformiert, um die primären Zilien, einen sensorischen Organelle aus der Zelloberfläche herausragen 2 zusammenzubauen. Sobald die Zellen erneut in den Zellzyklus werden die primären Zilien zerlegt und jedes centriole lenkt den Zusammenbau eines procentriole an seinem proximalen Ende, die sich allmählich verlängert, um eine reife centriole 3 bilden. Zu Beginn der S-Phase wird ein Wagenrad artigen Struktur, die das 9-fache Symmetrie um Centriols stellt auf der Oberfläche eines jeden vorhandenen centriole gebildet und wird die Basis jedes procentriole geworden. SAS6 tHut ist unverzichtbar für centriole Baugruppe wird eingestellt, um die Nabe der Wagenrad 4-6 zu bilden. Andere centriolar Proteine werden dann auf das Wagenrad in einem stark reguliert, von proximal nach distal Weise 7 montiert. Nach genau Abschluss centriole Vervielfältigung, Zellen zusammen zusätzliche pericentriolar Materialien zu zwei Funktions Zentrosomen bis Ende G2-Phase 8 bauen. Neben den Kern centriolar Komponenten 9-11, mehrere andere Proteine einschließlich Kinasen, Phosphatasen, Chaperone, Gerüstteile, membranassoziierte Proteine und Abbaumaschinen mit Centriolen, Basalkörpern und PCM zu unterschiedlichen Zeitpunkten des Zellzyklus 12-16 verbunden. Es wird oft festgestellt, dass die zentrosomale Ebenen vieler Proteine sind zeitlich um zentrosomale Targeting-Mechanismen und / oder auf den proteasomalen Abbau Zentrosomen geregelt. Wichtig ist, dass die Schwankungen der zentrosomalen Pegel mehrerer Proteine wie Plk4, Mps1, SAS6 und CP110 eint unterschiedlichen Punkten des Zellzyklus scheint entscheidend centriole Anordnung 5,17-22 regulieren zu können, und im Falle von Mps1 Verhinderung dieser zentrosomalen Abbau führt zur Bildung von überschüssigem Centriolen 19. Andererseits sind die zentrosomalen Fraktionen von mehreren Proteinen weniger labil gegenüber cytosolischen Pools. Zum Beispiel Herunterregulierung der Centrin 2 (Cetn2) siRNA-vermittelte führte nur zu einem moderaten Rückgang der Protein-Ebene an den Zentriolen trotz großer Verminderung seiner ganzen Zelle Ebenen 23. Es ist daher von entscheidender Bedeutung, um die Änderungen in der Ebene der zentrosomalen Proteine am Centrosom anstelle der Messung der Gesamtzellproteinspiegel bei der Bewertung ihrer Zentrosomen spezifische Funktionen zu messen.
In dieser Studie haben wir einen Test unter Verwendung der indirekten Immunfluoreszenz (IIF), das relative Niveau eines Proteins an Zentrosomen zu quantifizieren. Dieser Test ist besonders entwickelt, um Zellen, die aus verschiedenen Proben zu analysierenund können daher nicht gleichzeitig abgebildet werden. Diese Proben können die Zellen, die mit verschiedenen Reagenzien (dh Medikament gegen Kontrolle), die zu verschiedenen Zeitpunkten gesammelt, behandelt wurden (dh Pulsgegen chase) oder in verschiedenen Phasen des Zellzyklus. Das Prinzip dieses Tests besteht in der Messung der korrigierte Hintergrundfluoreszenzintensität, die ein Protein in einem kleinen Bereich und um diesen Wert gegen den gleichen für ein anderes Protein, deren Pegel nicht unter den gewählten experimentellen Bedingungen variieren normalisieren. Mehrere Studien in Biologie Zentrosom vor kurzem benutzt verschiedene quantitative Mikroskopie-Techniken, in beiden Live-oder fixierten Zellen, um das Zentrosom-spezifische Funktion der Kandidatenproteine 24-27 bestimmen. Ähnlich den Tests misst die vorliegende Technik auch den Hintergrund korrigierten Fluoreszenzintensität des Testproteins. Jedoch würde die Einbeziehung der Normalisierung mit internem Standard in diesem Test wahrscheinlich größer anbietenGenauigkeit und Sicherheit bei der Analyse von zwei verschiedenen Proben, die auf zwei verschiedenen Deckgläser sind. Ferner, zusätzlich zu der Prüfung des Protein-Ebene zu Zentrosomen, mit geringfügigen Anpassungen dieses Verfahren kann auf einen unterschiedlichen Satz von Testbedingungen oder in anderen zellulären Stellen aufgebracht werden.
Dabei kombinieren wir unsere quantitativen Mikroskopie Assay mit einem BrdU Pulse-Chase-Strategie, um Zellen aus verschiedenen Zellzyklusphasen zu vergleichen. Anstelle der Verwendung von Standard-Zellzyklusarrest und Trenntechniken, um verschiedene Zellzykluszeitpunkten zu untersuchen, asynchron wachsenden Zellen werden mit BrdU inkubiert, um Zellen in die S-Phase zu kennzeichnen, und die markierten Zellen werden für unterschiedliche Zeiten (typischerweise 4-6 Stunden) verfolgt. Die meisten der markierten Zellen in S-Phase unmittelbar nach dem Impuls sein. Die Länge der Lauflicht wird so gewählt, daß nach dem Chase werden markierte Zellen in späten S, G2 oder Mitose voranzuschreiten, was durch morphologische Merkmale wie-Position Zentrosomen bezüglich nuc prüft werden könnenleu, Abstand zwischen Zentrosomen, Kondensation Chromosomen usw. Somit kann die Länge des den Punkt von der mittleren Dauer der S, G2 und M Phase einen bestimmten Zelltyp. Da dieser Ansatz vermeidet Zellzyklus-Inhibitoren, wie Hydroxyharnstoff, Aphidicolin, Nocodazol usw., erlaubt es eine physiologisch relevante Zellzyklusanalyse.
Somit zeigen wir hier, dass die quantitative Fluoreszenzmikroskopie Assay allein oder in Kombination mit BrdU Pulse-Chase-Assay ist eine einfache, aber leistungsfähige Technik, um die relativen Änderungen der zentrosomalen Pegel eines Kandidatenprotein während einer ungestörten Zellzyklus genau zu messen. Wir maßen die zentrosomale Niveau VDAC3, ein Protein, das wir an Zentrosomen zusätzlich kürzlich identifizierten Mitochondrien 16,28, mit diesen Tests. Ergebnisse hier erzielt überprüfen unseren früheren Beobachtungen, dass der Pool von zentrosomale VDAC3 durch Abbau reguliert und variiert ebenfalls in einer Zellzyklus dependent Weise 16, ferner die Validierung der Anwendbarkeit dieses Verfahrens.
Quantitative Mikroskopie in der Zellbiologie wird häufig mit Live-Cell-Imaging-Assays wie Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET), Fluorescence Recovery After Photobleaching verbunden (FRAP) usw. Allerdings gibt es wachsende Beispiele für Zellbiologen entwickeln verschiedene quantitative Mikroskopie Assays für feste Zellen in den letzten Jahren 27,34-36. Wichtig ist, dass Fortschritte im Verständnis der Biologie Zentrosom häufig erfordert Verständnis der Zentrosom spezifische Funktion von…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a National Institutes of Health grant (GM77311) and a seed grant from The Ohio Cancer Research Associates (to H.A.F.). SM was partially supported by an Up on the Roof fellowship from the Human Cancer Genetics Program of The Ohio State University Comprehensive Cancer Center.
Name | Company | Catalog number | Comments |
Fibronectin | Sigma | F8141 | Stock of 1 mg/ml in water |
DMSO | Sigma | D2650 | |
MG115 | Sigma | SCP0005 | Stock of 10 mM in DMSO |
BrdU | Sigma | B5002 | Stock of 10 mM in DMSO |
Anti-g-tubulin (mouse monoclonal, clone GTU 88) | Sigma | T 6557 | 1:200 in IIF blocking buffer |
Anti-VDAC3 (rabbit polyclonal) | Aviva Systems Biology | ARP35180-P050 | 1:50 in IIF blocking buffer, 1:1000 in WB blocking buffer |
Anti-Sas6 (mouse monoclonal) | Santa cruz biotechnology | sc-81431 | 1:100 in IIF blocking buffer |
Anti-Cep135 (rabbit polyclonal) | Abcam | ab-75005 | 1:500 in IIF blocking buffer |
Anti-BrdU (rat monoclonal) | Abcam | ab6326 | 1:250 in IIF blocking buffer |
Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L) | Life technologies | A21093 | 1:200 in IIF blocking buffer |
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21202 | 1:1000 in IIF blocking buffer |
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21203 | 1:1000 in IIF blocking buffer |
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21206 | 1:1000 in IIF blocking buffer |
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21207 | 1:1000 in IIF blocking buffer |
Anti-g-tubulin (rabbit polyclonal) | Sigma | T5192 | 1:1000 in WB blocking buffer |
Anti-a-tubulin (mouse monoclonal, DM1A) | Sigma | T9026 | 1:20000 in WB blocking buffer |
Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Life technologies | A10043 | 1:10000 in WB blocking buffer |
Mouse IgG (H&L) Antibody IRDye800CW Conjugated | Rockland antibodies | 610-731-002 | 1:10000 in WB blocking buffer |
SlowFade Gold Antifade Reagent | Life technologies | S36936 | Mounting media |
Round coverslips 12CIR.-1 | Fisherbrand | 12-545-80 | |
Olympus IX-81 microscope | Olympus | ||
Retiga ExiFAST 1394 IR camera | QImaging | 32-0082B-238 | |
100X Plan Apo oil immersion objective | Olympus | 1.4 numerical aperture | |
Slidebook software package | Intelligent Imaging Innovations | ||
Odyssey IR Imaging System | Li-cor Biosciences | ||
Bicinchoninic acid (BCA) assay | Thermo Scientific | 23227 | |
U-MNU2 Narrow UV cube | Olympus | U-M622 | Filter |
U-MNU2 Narrow Blue cube | Olympus | U-M643 | Filter |
U-MNU2 Narrow Green cube | Olympus | U-M663 | Filter |