मात्रात्मक इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख Centrosomes में प्रोटीन का स्तर में रूपांतर उपाय
Summary
Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein’s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.
Abstract
Centrosomes जीनोमिक अखंडता को बनाए रखने या कोशिकाओं में संवेदी कार्यों की सुविधा के लिए प्राथमिक सिलिया को इकट्ठा करने के mitotic धुरी के डंडे के रूप में सेवा है कि छोटी लेकिन महत्वपूर्ण अंगों हैं। एक प्रोटीन का स्तर अन्य .cellular स्थानों पर से centrosomes पर अलग ढंग से विनियमित किया जा सकता है, और सेल चक्र के विभिन्न बिंदुओं पर कई प्रोटीन की centrosomal स्तर में भिन्नता तारककेंद्रक विधानसभा का उचित नियमन के लिए महत्वपूर्ण प्रतीत होता है। हम इस तरह के सेल चक्र के विभिन्न चरणों में के रूप में या विभिन्न अभिकर्मकों के साथ उपचार के बाद विभिन्न नमूनों से तय कोशिकाओं में centrosomes पर एक प्रोटीन के स्तर में रिश्तेदार परिवर्तन, उपाय है कि एक मात्रात्मक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी परख विकसित किया है। इस परख के सिद्धांत के एक छोटे से क्षेत्र में एक प्रोटीन के लिए इसी पृष्ठभूमि को सही फ्लोरोसेंट तीव्रता को मापने में निहित है, और चुने हुए प्रयोगात्मक सी के तहत भिन्न नहीं है कि एक और प्रोटीन के लिए एक ही खिलाफ है कि माप मानक के अनुसारondition। BrdU के नाड़ी और बेफिक्र सेल चक्र का अध्ययन करने के लिए पीछा रणनीति के साथ संयोजन में इस परख का उपयोग, हम मात्रात्मक विशेष रूप से centrosomes पर Proteasome की मध्यस्थता गिरावट से होने की संभावना VDAC3 की centrosomal पूल सेल चक्र के दौरान centrosomes पर नियंत्रित किया जाता है कि हमारे हाल के अवलोकन, पुष्टि की है।
Introduction
Centrosomes pericentriolar सामग्री (पीसीएम) से घिरा हुआ centrioles की एक जोड़ी से मिलकर बनता है। स्तनधारी कोशिकाओं में प्रमुख सूक्ष्मनलिका आयोजन केन्द्रों (MTOCs) होने के नाते, centrosomes विभाजित कोशिकाओं में mitotic spindles के दो ध्रुवों के रूप में सेवा, और इस तरह जीनोमिक अखंडता एक बनाए रखने में मदद। (G0 चरण के दौरान जैसे,) मौन कोशिकाओं में, सेंट्रोसोम, अर्थात् मां तारककेंद्रक के दो centrioles में से एक, प्राथमिक पपनी, कोशिका की सतह 2 से बाहर फैला हुआ एक संवेदी organelle इकट्ठा करने के लिए एक बेसल शरीर में तब्दील हो जाता है। एक बार कोशिकाओं सेल चक्र फिर से दर्ज, प्राथमिक सिलिया disassembled और प्रत्येक तारककेंद्रक धीरे-धीरे एक परिपक्व तारककेंद्रक 3 के लिए फार्म elongates कि इसके समीपस्थ अंत में एक procentriole की विधानसभा का निर्देशन कर रहे हैं। एस चरण की शुरुआत में, तारककेंद्रक 9 गुना समरूपता प्रदान करता है कि एक गाड़ी का पहिया जैसी संरचना प्रत्येक मौजूदा तारककेंद्रक की सतह पर बनाई है और प्रत्येक procentriole का आधार बन जाएगा। Sas6 टीतारककेंद्रक विधानसभा गाड़ी का पहिया 4-6 के हब के फार्म के लिए भर्ती किया गया है के लिए टोपी अपरिहार्य है। अन्य centriolar प्रोटीन तो बाहर का ढंग 7 करने के लिए एक उच्च विनियमित, समीपस्थ में गाड़ी का पहिया पर इकट्ठा कर रहे हैं। ठीक तारककेंद्रक दोहराव पूरा करने के बाद, कोशिकाओं G2 के चरण 8 के अंत तक दो कार्यात्मक centrosomes का निर्माण करने के लिए अतिरिक्त pericentriolar सामग्री इकट्ठा। कोर centriolar घटकों 9-11, kinases, phosphatases, संरक्षिकाओं, पाड़ घटक, झिल्ली जुड़े प्रोटीन और गिरावट मशीनरी सहित कई अन्य प्रोटीन के अलावा सेल चक्र 12-16 के अलग अलग समय पर centrioles, बेसल शरीर और पीसीएम के साथ जुड़े रहे हैं। यह अक्सर कई प्रोटीन की centrosomal स्तरों अस्थायी centrosomal लक्ष्य-निर्धारण तंत्र और / या centrosomes पर proteasomal गिरावट द्वारा विनियमित रहे हैं कि उल्लेख किया है। महत्वपूर्ण बात है, ऐसे Plk4, Mps1, Sas6, और CP110 एक के रूप में कई प्रोटीन की centrosomal स्तर में उतार-चढ़ावसेल चक्र के टी विभिन्न बिंदुओं तारककेंद्रक विधानसभा 5,17-22 को विनियमित करने के लिए महत्वपूर्ण प्रतीत होता है, और इस centrosomal गिरावट को रोकने Mps1 के मामले में अतिरिक्त centrioles 19 के गठन की ओर जाता है। दूसरी ओर, कई प्रोटीन की centrosomal अंशों साइटोसोलिक पूल की तुलना में कम अस्थिर कर रहे हैं। उदाहरण के लिए नीचे विनियमन Centrin 2 (Cetn2) की siRNA की मध्यस्थता अपने पूरे सेल का स्तर 23 में महान कमी के बावजूद centrioles में प्रोटीन के स्तर का केवल एक उदारवादी कमी करने के लिए नेतृत्व किया। बल्कि यह उनके सेंट्रोसोम-विशिष्ट कार्यों का आकलन करने के लिए जब पूरे सेल प्रोटीन के स्तर को मापने की तुलना में सेंट्रोसोम पर centrosomal प्रोटीन के स्तर में परिवर्तन को मापने के लिए इसलिए महत्वपूर्ण है।
इस अध्ययन में हम centrosomes पर एक प्रोटीन के रिश्तेदार स्तर यों तो अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस (IIF) का उपयोग कर एक परख विकसित किया है। यह परख विभिन्न नमूनों से कर रहे हैं कि कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए विशेष रूप से विकसित की हैऔर इस तरह एक ही समय में imaged नहीं किया जा सकता। इन नमूनों अलग समय बिंदुओं पर एकत्र अलग अभिकर्मकों (यानी, औषध नियंत्रण बनाम), के साथ इलाज किया गया है कि कोशिकाओं हो सकता है (यानी, पीछा बनाम नाड़ी), या सेल चक्र के विभिन्न चरणों में हैं। इस परख के सिद्धांत पृष्ठभूमि को सही फ्लोरोसेंट तीव्रता के एक छोटे से क्षेत्र में एक प्रोटीन के लिए इसी और जिसका स्तर चुना प्रयोगात्मक शर्तों के तहत भिन्न नहीं है एक और प्रोटीन के लिए एक ही खिलाफ है कि मूल्य को सामान्य करने को मापने में निहित है। सेंट्रोसोम जीव विज्ञान में कई अध्ययनों से हाल ही में उम्मीदवार प्रोटीन 24-27 की सेंट्रोसोम-विशेष समारोह का निर्धारण करने के लिए, दोनों रहते हैं या तय कोशिकाओं में विभिन्न मात्रात्मक माइक्रोस्कोपी तकनीक, का उपयोग किया है। उन assays के लिए इसी प्रकार, वर्तमान तकनीक को भी परीक्षण प्रोटीन की पृष्ठभूमि को सही प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापता है। हालांकि, इस परख में एक आंतरिक मानक का उपयोग सामान्य बनाने का समावेश होता संभावना अधिक की पेशकशसटीकता और दो अलग अलग coverslips पर कर रहे हैं कि दो विभिन्न नमूनों का विश्लेषण करने में विश्वास। इसके अलावा, centrosomes में प्रोटीन के स्तर की जांच करने के अलावा, मामूली समायोजन के साथ इस विधि प्रयोगात्मक शर्तों की एक विविध सेट करने के लिए या अन्य सेलुलर स्थलों पर लागू किया जा सकता है।
यहाँ, हम अलग अलग सेल चक्र के चरणों से कोशिकाओं की तुलना करने के लिए एक BrdU के नाड़ी-पीछा रणनीति के साथ हमारे मात्रात्मक माइक्रोस्कोपी परख गठबंधन। इसके बजाय, विभिन्न सेल चक्र समय बिंदुओं का अध्ययन करने के asynchronously बढ़ कोशिकाओं मानक सेल चक्र गिरफ्तारी और रिहाई की तकनीक का उपयोग कर के एस चरण में कोशिकाओं लेबल BrdU के साथ incubated रहे हैं, और लेबल की कोशिकाओं में विभिन्न समय (आमतौर पर 4-6 घंटा) के लिए पीछा कर रहे हैं। लेबल की कोशिकाओं के सबसे तुरंत नाड़ी के बाद एस चरण में होगा। पीछा करने के बाद, लेबल कोशिकाओं रूपात्मक विशेषताओं NUC के लिए सम्मान के साथ centrosomes के जैसे- स्थिति द्वारा सत्यापित किया जा सकता है, जो देर हो चुकी है, G2 है, या पिंजरे का बँटवारा, में होगा तो यह है कि पीछा करने की लंबाई चुना जाता हैलेई, centrosomes के बीच की दूरी, आदि के गुणसूत्रों का संक्षेपण प्रकार, पीछा करने की लंबाई एस, G2 और एक विशेष सेल प्रकार के एम चरण की औसत अवधि पर निर्भर करता है। इस दृष्टिकोण आदि hydroxyurea, aphidicolin, nocodazole, के रूप में सेल चक्र अवरोधकों से बचा जाता है के बाद से, यह एक और अधिक physiologically प्रासंगिक सेल चक्र विश्लेषण की अनुमति देता है।
इस प्रकार, हम अकेले मात्रात्मक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी परख, या BrdU के नाड़ी-पीछा परख के साथ संयोजन में, सही ढंग से एक बेफिक्र सेल चक्र के दौरान एक उम्मीदवार प्रोटीन की centrosomal स्तर में रिश्तेदार परिवर्तन को मापने के लिए एक सरल अभी तक शक्तिशाली तकनीक है कि यहाँ प्रदर्शित करता है। हम इन assays का उपयोग, VDAC3, हमने हाल ही में 16,28 माइटोकॉन्ड्रिया के अलावा centrosomes में पहचान की है कि एक प्रोटीन की centrosomal स्तर मापा जाता है। यहां प्राप्त परिणामों VDAC3 की centrosomal पूल गिरावट द्वारा नियंत्रित किया जाता है कि हमारे पिछले प्रेक्षण सत्यापित, और यह भी एक कोशिका चक्र dependen में बदलता हैटी ढंग 16, इसके अलावा इस पद्धति के प्रयोग को मान्य किया।
Protocol
Representative Results
Discussion
कोशिका जीव विज्ञान में मात्रात्मक माइक्रोस्कोपी आमतौर पर निश्चित लिए अलग मात्रात्मक माइक्रोस्कोपी assays के विकासशील सेल जीव विज्ञानियों की बढ़ती उदाहरण हैं, हालांकि आदि, photobleaching (FRAP) के बाद इस तरह के प्…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a National Institutes of Health grant (GM77311) and a seed grant from The Ohio Cancer Research Associates (to H.A.F.). SM was partially supported by an Up on the Roof fellowship from the Human Cancer Genetics Program of The Ohio State University Comprehensive Cancer Center.
Materials
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Fibronectin | Sigma | F8141 | Stock of 1 mg/ml in water |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| MG115 | Sigma | SCP0005 | Stock of 10 mM in DMSO |
| BrdU | Sigma | B5002 | Stock of 10 mM in DMSO |
| Anti-g-tubulin (mouse monoclonal, clone GTU 88) | Sigma | T 6557 | 1:200 in IIF blocking buffer |
| Anti-VDAC3 (rabbit polyclonal) | Aviva Systems Biology | ARP35180-P050 | 1:50 in IIF blocking buffer, 1:1000 in WB blocking buffer |
| Anti-Sas6 (mouse monoclonal) | Santa cruz biotechnology | sc-81431 | 1:100 in IIF blocking buffer |
| Anti-Cep135 (rabbit polyclonal) | Abcam | ab-75005 | 1:500 in IIF blocking buffer |
| Anti-BrdU (rat monoclonal) | Abcam | ab6326 | 1:250 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L) | Life technologies | A21093 | 1:200 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21202 | 1:1000 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21203 | 1:1000 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21206 | 1:1000 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21207 | 1:1000 in IIF blocking buffer |
| Anti-g-tubulin (rabbit polyclonal) | Sigma | T5192 | 1:1000 in WB blocking buffer |
| Anti-a-tubulin (mouse monoclonal, DM1A) | Sigma | T9026 | 1:20000 in WB blocking buffer |
| Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Life technologies | A10043 | 1:10000 in WB blocking buffer |
| Mouse IgG (H&L) Antibody IRDye800CW Conjugated | Rockland antibodies | 610-731-002 | 1:10000 in WB blocking buffer |
| SlowFade Gold Antifade Reagent | Life technologies | S36936 | Mounting media |
| Round coverslips 12CIR.-1 | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| Olympus IX-81 microscope | Olympus | ||
| Retiga ExiFAST 1394 IR camera | QImaging | 32-0082B-238 | |
| 100X Plan Apo oil immersion objective | Olympus | 1.4 numerical aperture | |
| Slidebook software package | Intelligent Imaging Innovations | ||
| Odyssey IR Imaging System | Li-cor Biosciences | ||
| Bicinchoninic acid (BCA) assay | Thermo Scientific | 23227 | |
| U-MNU2 Narrow UV cube | Olympus | U-M622 | Filter |
| U-MNU2 Narrow Blue cube | Olympus | U-M643 | Filter |
| U-MNU2 Narrow Green cube | Olympus | U-M663 | Filter |
Referências
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