Se describe la combinación de focal foto-activación inducida por UV de compuestos neuroactivos con células enteras patch-clamp y las imágenes de múltiples fotones de los transitorios de sodio intracelulares en dendritas y espinas de las neuronas del hipocampo en cortes de tejido agudas del cerebro de ratón.
Microscopía de fluorescencia Multi-fotón ha permitido el análisis de parámetros morfológicos y fisiológicos de las células del cerebro en el tejido intacto con alta resolución espacial y temporal. Combinado con la electrofisiología, se utiliza ampliamente para estudiar las señales de calcio relacionados con la actividad en pequeños compartimentos subcelulares tales como dendritas y espinas dendríticas. Además de los transitorios de calcio, la actividad sináptica también induce señales de sodio postsinápticos, las propiedades de los cuales son sólo marginalmente entendidos. Aquí se describe un método para su conjunto de células patch-clamp combinado y de imagen de sodio multi-fotón en celulares dominios micro de las neuronas centrales. Además, se introduce un procedimiento modificado para la ultra-violeta (UV) uncaging inducida -light de glutamato, que permite la activación fiable y focal de receptores de glutamato en el tejido. Para este fin, las grabaciones de células enteras se realizaron en Cornu Ammonis subdivisión 1 (CA1) neuronas piramidales en cortes de tejido agudos de lahipocampo del ratón. Las neuronas se llenaron con el colorante fluorescente SBFI sensible al sodio a través del parche pipeta, y multi-fotón de excitación de SBFI permitieron la visualización de las dendritas y espinas adyacentes. Para establecer uncaging focal inducida por UV, varios parámetros, incluyendo la intensidad de luz, volumen afectado por el haz uncaging UV, el posicionamiento de la viga así como la concentración del compuesto enjaulado fueron probados y optimizados. Nuestros resultados muestran que la perfusión local con glutamato enjaulado (MNI-glutamato) y su focal resultado-UV uncaging en corrientes hacia el interior y los transitorios de sodio en las dendritas y espinas. Transcurso de tiempo y la amplitud de las dos corrientes de entrada y las señales de sodio se correlacionan con la duración del impulso de uncaging. Además, nuestros resultados muestran que las señales intracelulares de sodio están bloqueados en presencia de bloqueadores para los receptores de glutamato ionotrópicos, lo que demuestra que están mediadas por la entrada de sodio, aunque esta vía. En resumen, nuestro método proporciona una herramienta fiable para lainvestigación de señales intracelulares de sodio inducida por la activación del receptor en el tejido cerebral focal intacto.
Las recientes mejoras en técnicas microscópicas, tales como la microscopía de luz multi-fotón han permitido el estudio de parámetros morfológicos y fisiológicos de las células del cerebro en el tejido intacto con alta resolución espacial y temporal. Combinado con la electrofisiología, estas técnicas son ampliamente utilizados para analizar las señales eléctricas relacionadas con la actividad de las neuronas, así como las señales de calcio concomitantes en pequeños compartimentos subcelulares, es decir, en finas dendritas y espinas dendríticas. Además de los transitorios de calcio, la actividad sináptica también induce señales de sodio en las dendritas y espinas, las propiedades de las que son en gran parte inexplorado. Tales señales pueden ser analizados mediante formación de imágenes de dos fotones de sodio intracelular ([Na +] i), que permite la medición en línea de [Na +] i transitorios por períodos prolongados sin blanqueo tinte significativa o foto-daño 1,2.
Para imágenes de i [Na +] </sub>, sólo unos pocos colorantes indicadores químicos están disponibles, por ejemplo, Corona Verde o Asante Natrium Verde 3,4. La sonda fluorescente más comúnmente utilizado para obtener imágenes de Na + es isoftalato de benzofurano (SBFI) de unión de sodio. Es un radiométrica, colorante UV excitada similar a la conocida colorante sensible al calcio fura-2 y se ha empleado para formación de imágenes convencional Na + en muchos tipos de células (por ejemplo, 5,6). Hay diferentes posibilidades de excitar el colorante y la recogida de su fluorescencia. Si se requiere alta resolución temporal (es decir, una velocidad de fotogramas de imagen de alta) en combinación con la información espacial, SBFI puede ser excitado con una lámpara de arco de xenón o un diodo (LED) dispositivo emisor de luz de alta potencia y su emisión detectada con una carga de alta velocidad dispositivo-junto (CCD) 7,8 cámara. Para la resolución espacial máxima profundidad en el tejido, la microscopía de barrido láser multi-fotón es el método de elección 9. El efficie cuántica relativamente bajancy de SBFI requiere concentraciones relativamente altas de tinte (0,5-2 mM), y la carga directa de la forma de membrana impermeable de SBFI a través de un microelectrodo agudo 10 o parche pipeta 1.
Usando SBFI, trabajo anterior realizado en cortes de tejido agudos de hipocampo de roedores demostró transitorios sodio relacionados con la actividad en las dendritas y espinas de las neuronas piramidales CA1 que son causadas principalmente por el influjo de sodio a través de receptores ionotrópicos NMDA 1,2. Para el estudio de las propiedades de dichas señales de sodio locales en más detalle, la activación específica de los receptores postsinápticos por aplicación de agonistas de los receptores es un método muy adecuado de elección. Para imitar la actividad presináptica y la liberación del transmisor, la aplicación debe ser relativamente breve y centrado para permitir la estimulación local. Esto, sin embargo, resulta ser bastante difícil en el tejido intacto. Aplicación de presión local de agonistas de los receptores utilizando una pipeta con punta fina permite ap muy focalplicatura, pero alberga el riesgo potencial para producir el movimiento de la estructura de interés (por ejemplo, como una dendrita o espinas dendríticas), y por lo tanto dificulta la proyección de imagen de alta resolución. La idoneidad de la iontoforesis de sustancias neuro-activo depende de sus propiedades eléctricas y las altas amplitudes de corriente puede producir artefactos celulares también.
Una forma de soslayar estos obstáculos es el empleo de compuestos foto-activado y su fotólisis flash. Básicamente, dos principios diferentes se utilizan para la foto-activación de sustancias enjaulados: I) de campo amplio de flash fotólisis 11 y II) uncaging focal empleando módulos de análisis en combinación con el láser 12. Si bien en todo el campo de flash fotólisis se utiliza para activar las regiones más grandes de interés, por ejemplo, una célula entera, se emplea uncaging focal para estimular específicamente pequeños compartimentos celulares. En el presente estudio se demuestra un procedimiento para de células enteras patch-clamp y multi-pformación de imágenes de sodio Hoton en las dendritas y espinas de las neuronas centrales, combinada con un procedimiento modificado para uncaging inducida por luz UV de glutamato, que permite la activación fiable y focal de receptores de glutamato en el tejido.
El presente estudio muestra que SBFI es muy adecuado para formación de imágenes de dos fotones de los transitorios de sodio intracelulares en pequeños compartimentos celulares. Tiene que tenerse en cuenta, sin embargo, que la eficiencia cuántica de SBFI es más bien baja 15 y relativos cambios en la concentración de sodio son bastante pequeñas con actividad fisiológica. Por lo tanto, la medición de alta resolución de los transitorios de Na + en los procesos de finos es una tarea relativamente tedioso, y binning o promediación de varios ensayos puede ser necesario para obtener señales satisfactorios. Además, la cinética de los transitorios de sodio son sorprendentemente lenta, por lo que es obligatorio para grabar durante períodos de tiempo prolongados. Esta observación se corresponde con los de estudios anteriores, donde la caries monoexponencial de los transitorios de sodio en las dendritas neuronales y en los astrocitos se caracteriza por constantes de tiempo grandes descomposición en el intervalo de 10 segundos a temperatura ambiente 1,2,6. Por lo tanto los transitorios de sodio parecen ejercer un momento co mucho más lentourse y mucho más grandes constantes de tiempo de decaimiento, en comparación con los transitorios de calcio 16.
Ponga a un lado estos inconvenientes, las imágenes de sodio ha demostrado ser una herramienta valiosa para la investigación de las propiedades fisiológicas de subdominios neuronales. Por ejemplo, las imágenes de sodio puede servir para controlar la actividad sináptica excitatoria en o cerca de las sinapsis activas. Debido esencialmente de sodio no está tamponada 8,17, transitorios de sodio inducida por la actividad están relacionadas linealmente a una amplia gama de la liberación de glutamato sináptico de glutamato o exógenamente aplicados. Ellos por lo tanto, representan indicadores directos e imparciales de la actividad glutamatérgica neuronal. Además, colorantes indicadores de sodio presentan una alta K d 's (de SBFI K d está en el intervalo de 25 mM 1). Incluso en las concentraciones de colorante intracelulares relativamente altas usadas para lograr el brillo suficiente (generalmente 0,5-1 mM), el alto K d 's implica que los propios tintes no actúan como amortiguadores para sodium. En consecuencia, no distorsionan el curso amplitud ni el tiempo de los transitorios de sodio, que es siempre una preocupación cuando tintes sensibles al calcio se introducen en las células 18. Por lo tanto, se puede suponer que las señales detectadas representan una buena medida de los cambios "reales" en sodio intracelular. Su evolución en el tiempo lento implica entonces que la velocidad para la difusión intracelular de sodio en las neuronas es mucho menor que anteriormente supone 19.
Un requisito fundamental para la exitosa ejecución de los experimentos que abordan las propiedades de las vías de transmisión y de afluencia de sodio sinápticos excitatorios en espinas y dendritas es la inducción de una activación rápida y muy localizada de estructuras postsinápticas. Esto se puede conseguir mediante la aplicación rápida y local de glutamato o agonistas de glutamato en la vecindad directa de una columna o una dendrita por la fotolisis de flash de compuestos enjaulados. Fotólisis flash hace dama no mecánicamentege el tejido, está libre de artefactos de movimiento y está bien establecido para la investigación de cuestiones relacionadas (por ejemplo, la señalización de calcio local). El diámetro de la mancha uncaging fue de 1,5 micras en el plano xy. Uncaging cerca de una señal de sodio dendritas espinosas inducidas en las dos espinas y la dendrita padres. Considerando que las señales tendían a ser más grande en las espinas más cercanos al lugar uncaging, las amplitudes en la dendrita de los padres y espinas más lejos todavía eran bastante similares a aquellos en proximidad directa de la mancha uncaging. Uncaging se realizó durante 300 mseg durante el cual corrientes hacia el interior aumentaron en amplitud. Glutamato Uncaged podría haber difundido en el tejido durante el mismo período de tiempo, la activación de los receptores ionotrópicos de glutamato y la entrada de sodio en las regiones dendríticas y espinas más lejos del punto uncaging.
Un problema intrínseco que se produce cuando se utiliza un láser UV para la fotólisis de compuestos enjaulados administrados a través de la solución de baño de célulases 'de filtrado interno'. Debido a la alta tasa de absorción de la jaula, la luz UV se atenúa fuertemente a lo largo del camino desde el objetivo a la zona de estimulación 20,21. Una manera posible de evitar esto es la perfusión local con la jaula que se limita sólo a la zona de estimulación, lo que disminuye, además, la cantidad de compuesto necesaria enjaulado a un mínimo. En comparación con uncaging mediada por escaneo láser UV, cerca de infra-rojo de dos fotones uncaging 22 es espacialmente más precisa, principalmente debido a la precisión de la estimulación se incrementa en el eje z. Por otro lado, debido a la sección transversal pequeña de las jaulas comúnmente utilizados para longitudes de onda más largas como se emplea con excitación de dos fotones, ya sea una alta concentración del compuesto enjaulado o muy alta, se necesitan intensidades de luz potencialmente fototóxicas. Además, uncaging de dos fotones requiere una inversión mucho mayor en el equipo; entre otros, un láser IR adicional, más los componentes ópticos necesarios, se necesitan.
Tanto SBFI y MNI-glutamato son excitables en el rango de longitud de onda idénticas. Esto puede conducir a una interdependencia involuntaria de láser UV uncaging y SBFI o láser de formación de imágenes IR y MNI-glutamato, lo que resulta en el blanqueo de SBFI por el flash uncaging y / o un uncaging continua de glutamato por el haz IR. Sin embargo, como se muestra en la Figura 6C, ni un destello UV por sí mismo ni la formación de imágenes de múltiples fotones causado tales efectos recíprocos en las condiciones experimentales.
Sistemas UV en flash similar a la descrita aquí se utilizan de forma rutinaria en muchos otros laboratorios y pueden con relativa facilidad pueden incorporar en cualquier microscopio de imagen multi-fotón existente. Ofrece la ventaja de que el haz de láser para la fotólisis se puede colocar libremente en el campo de visión. Además, el sistema permite un reposicionamiento rápido y automatizado del haz de láser y el volumen de liberación, respectivamente, en el campo de visión durante un experimento. Our modificación simplifica y mejora el posicionamiento preciso del punto uncaging, de modo que los marcos de la formación de imágenes de software pueden servir para ajustar los marcos de imagen y uncaging congruentemente.
Tomados en conjunto, de células enteras patch-clamp de sodio y de formación de imágenes multi-fotón en dendritas y espinas de las neuronas centrales, combinada con un procedimiento modificado para uncaging UV-inducida por la luz de glutamato, permite la activación fiable y focal de receptores de glutamato en el tejido. De este modo, puede servir para analizar las propiedades de la transmisión sináptica excitatoria y de señales de sodio en las neuronas postsinápticas en el tejido intacto.
The authors have nothing to disclose.
Este estudio fue apoyado por una beca de la Fundación Alemana de Ciencias (DFG, Ro2327 / 6-1) a CRR Los autores desean agradecer a S. Durry y C. Rodrigo de asistencia técnica de expertos, y M. Dubbert (Laboratorio de Electrónica, Instituto Zoológico , Universidad de Colonia, Alemania) para obtener ayuda en la aplicación del controlador de la célula Pockels y el interruptor de HF.
Hadrware/Software Component | Manufacturer | Tipo | Comment |
Borosilicate-glass capillaries | Hilgenberg | 1405059 | 75 mm x 2 mm, wall thickness 0.3 mm |
Camera | Jenoptik | ProgRes MF | IR-DIC compatible camera |
Deconvolution software | SVI | Huygens Pofessional X11 | |
Fiber optic spectrometer | Ocean Optics | USB 4000 | Miniature fiber optic spectrometer |
Filter tubes | VWR | cenrifugal filter, 0.2 µm | |
Imaging software | Olympus Europe | Flowview Ver 5.0c, Tiempo | |
IR beam power controller | Custom built | Laser beam intensity control + fast switch to zero on flyback via pockels cell | |
IR laser | SpectraPhysics | Mai-Tai VF-N1S | fs-pulsed Ti:Sa tunable laser (710-990 nm); CAUTION |
IR power monitor | Custom built | ||
Micromanipulator | Burleigh | PCS 5000 | |
Microscope/Imaging System | Olympus Europe | BX51WI/FV300 | Both, the microscope and the imaging systems were strongly modified |
ND filter wheel | Newport | 50Q04AV.2 | UV fused silica, optical density 0.05-2.0 |
Objective | Nikon Instruments Europe | NIR Apo 60x/1.0w | |
Patch clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
Pipette puller | Narishige | Model PP-830 | |
Pneumatic drug ejection system | NPI Electronic | PDES-DXH | |
Pockels cell | Conoptics | 350-80 LA-BK | EOM, used as fast switch and for power adjustment |
Pockels cell driver | Conoptics | M302-RM | High voltage differential amplifier |
Shutter | Vincent Associates | LS6ZM2 | ALMgF2-coated BeCu blades |
Shutter controller | Custom built | ||
Shutter driver | Vincent Associates | Uniblitz VCM D1 | |
Slicer / Vibratome | Thermo Scientific | Microm HM 650 V | |
Uncaging software | Rapp OptoElectronic | UGA40 1.1.2.6 + NetCam | |
UV laser | Rapp OptoElectronic | DL-355/10 | cw DPSSL Laser, 355 nm; 10 mW; CAUTION |
UV laser scanning system | Rapp OptoElectronic | UGA 40 | Galvanometric scanning system |
Name of Compound | Catalog Number | Comments/Description | |
CNQX | Sigma Aldrich | C-127 | AMPA receptor antagonist; CAUTION |
DL-AP5 | Alfa Aesar | J64210 | NMDA receptor antagonist; CAUTION |
SBFI K+ Salt | Teflabs | OO32 | |
TTX | Ascent Scientific | Asc-055 | Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION |
NMI-caged-L-Glutamate | Torcis | 1490 | Caged glutamatereleased upon UV absobtion |