Toxikologiska Analyser för Testing Effekter av en epigenetisk Drug för utveckling, Fruktsamhet och Survivor av malariamyggor

Summary

A protocol is developed to examine the effects of an epigenetic drug DZNep on the development, fecundity and survivorship of mosquitoes. Here we describe procedures for the aqueous exposure of DZNep to immature mosquitoes and a blood-based exposure of DZNep to adult mosquitoes in addition to measuring SAH hydrolase inhibition.

Abstract

Insekticid resistens utgör ett stort problem för malariakontrollprogram. Myggor anpassa sig till ett brett spektrum av förändringar i miljön snabbt, vilket gör malaria styra en allestädes närvarande problem i tropiska länder. Framväxten av insektsresistenta populationer motiverar utforskandet av nya läkemedelsmål vägar och föreningar för vektormyggkontroll. Epigenetiska läkemedel är väl etablerade inom cancerforskningen, men inte mycket är känt om deras effekter på insekter. Denna studie ger ett enkelt protokoll för att pröva de toxikologiska effekterna av 3-Deazaneplanocin A (DZNep), en experimentell epigenetisk läkemedel för cancerbehandling, på malaria vektorn, Anopheles gambiae. En koncentrationsberoende ökning av mortaliteten och minskar i storlek observerades i omogna myggor exponerats för DZNep, medan föreningen reducerade fertiliteten hos vuxna myggor relativt kontrollbehandlingar. Dessutom fanns det en läkemedelsberoende minskning av S -adenosylhomocystein (SAH) hydrolasaktivitet i myggor efter exponering för DZNep jämfört med kontrollbehandlingar. Dessa protokoll ger forskaren med en enkel, steg-för-steg-förfarande för att bedöma flera toxikologiska endpoints för en experimentell drog och i sin tur, visar en unik multi stift strategi för att utforska de toxikologiska effekterna av vattenlösliga epigenetiska läkemedel eller föreningar av intresset mot vektor mygg och andra insekter.

Introduction

Malaria är ansvarig för det högsta antalet insektsrelaterade dödsfall i världen. Uppskattningsvis 219 miljoner fall inträffar årligen i hela världen, vilket resulterar i cirka 660.000 dödsfall, främst i Afrika ^1. Trots samordnade insatser, malariaprogram står inför flera utmaningar. Medan insecticidal behandlade bednets och indoor resterande besprutningen formulär nyckelkomponenter i programmet, resistens mot insekticider i lokala populationer hindra dessa ansträngningar ^2. Den snabba ökningen av insektsresistenta myggpopulationer beror i hög utsträckning förmåga malariamyggor att snabbt anpassa sig till förändringar i sin miljö och utnyttja olika nischer ^3,4,5. För att övervinna de befintliga mekanismerna för insektsresistens, är utforskandet av nya insekts mål och nästa generations föreningar motiverat. En enkel, steg-för-steg-protokoll för att bestämma effekten av experimentella insekticider på de olika stadierna av malaria mosquitoes skulle avsevärt förbättra dessa insatser.

Farmakologiska studier av läkemedelseffekter på cellinjer och djurmodeller har etablerat användningen av epigenetiska läkemedel som ett användbart verktyg för att modulera genetik och fysiologi av celler och organismer. DNA-metylering och histonmodifiering är två epigenetiska mekanismer som påverkar genuttryck i flercelliga organismer utan att ändra den underliggande DNA-sekvensen ^6. Inlägg translationella modifieringar såsom metylering spelar en avgörande roll för att upprätthålla cellulär integritet och genuttryck, och kan påverka flera grundläggande processer ^7,8,9. Forskning inom vissa insektsarter har lyft fram betydelsen av epigenetik i processer som involverar oogenes och stamcells underhåll ^10, samt dosering kompensation ^11. Men sådana aspekter i sjukdoms vektorer ännu på att utforskas. Med hjälp av en förening att modulera detta system myggor kan ge oss isevärdheter i de nya insektsmålgrupp vägar. 3-Deazaneplanocin A (DZNep) är en känd histon metylering hämmare, vilket påverkar olika typer av cancer har studerats ^{12,13,14,15,16.} DZNep är en stabil vattenlöslig epigenetisk läkemedel som indirekt inhiberar histon lysin N -methyltransferase (EZH2), en komponent av Polycomb repressiva komplexet 2 (PRC2) i däggdjursceller. PRC2 spelar en viktig roll i regleringen av tillväxten av stamceller i flercelliga organismer, och histon metylering är en viktig aspekt av PRC2 medierad geners uttryck. I immunförsvagade möss, har celler som förbehandlats med DZNep visats vara mindre tumörframkallande ^17. Detta läkemedel blir används för att studera andra sjukdomar, såsom alkoholfri fettlever, där EZH2 är inblandad ^18. DZNep är en etablerad S -adenosylhomocysteine ​​(SAH) hydrolas-hämmare ^{19, 20.} Hämningen av SAH hydrolas resulterar i enansamling av SAH och i sin tur leder till hämning av metyltransferasaktivitet genom att begränsa tillgängliga metyl givargrupper. SAH är ett aminosyraderivat utnyttjas av många organismer, inklusive insekter, i deras metaboliska vägar. En färsk studie har visat att DZNep i låga doser kan påverka diapaus och fördröja utvecklingen av insekter ^21.

Här är en robust protokoll för att undersöka effekterna av en vattenlöslig förening på olika livsstadier mygg utvecklas. De tre delarna av detta protokoll omfattar instruktioner för att undersöka effekterna av en vattenlöslig förening på omogna myggor, vuxna blod utfodring honor, och enzymaktiviteten hos vuxna manliga och kvinnliga myggor. Först DZNep löses i vatten för att studera omogna mygga utveckling och överlevnad. Detta utförs vid två koncentrationer för att jämföra skillnader som uppkommer från 10-faldig ökning av läkemedelsexponering. För att undersöka effekten av drogen på vuxna kvinnliga myggor, DZNepläggs till defibrilleras fårblod och matas blodet på konstgjord väg till honor. Därefter resultatet av drogen på fruktsamhet undersöktes. Slutligen en enzymaktivitetsanalys utförs med hjälp 5,5'-ditiobis- (2-nitrobensoesyra) (DTNB) som indikator för att bestämma effekten av DZNep på SAH hydrolas inhibition i vuxna manliga och kvinnliga myggor. Även om detta protokoll är utvecklad med ett malariamyggan, Anopheles gambiae, kan det enkelt anpassas till att studera effekterna av föreningar av intresse på alla arter av myggor eller andra insekter. De tekniker som beskrivs i detta protokoll får inte tillämpas effektivt till ett läkemedel med begränsad eller ingen löslighet i vatten eller vattenbaserade medier.

Protocol

OBS: De tre delarna av protokollet beskriver vattenhaltiga exponering av DZNep drogen till larv myggor, en blodbaserad exponering av DZNep till vuxna honor för att studera dess effekt av fruktsamhet, och SAH-hydrolas inhibition genom DZNep mätt med användning av en enkel kolorimetrisk teknik. En schematisk representation av dessa analyser visas i figur 1. 1. Omogna Mosquito Utveckling och efterlevande analyser OBS: Detta avsnitt förklarar anvä…

Representative Results

Figur 1 är en schematisk representation av analyserna; den beskriver de olika stegen i förfarandet och som anges i den här artikeln. Eftersom protokollet är baserat på olika livsstadier av mygg, det finns ingen särskild ordning som skall följas för experimenten som beskrivs här. Användaren kan välja att genomföra en eller flera analyser samtidigt, beroende på prov tillgänglighet. Figur 2 visar plattan inrättas för omogna mygga utveckli…

Discussion

Det finns flera steg som är avgörande för en framgångsrik tillämpning av detta protokoll. För larver analysen, bör försiktighet iakttas för att korrekt märka och replikera varje testkoncentration. Randomisera testprover och lägga den utsedda mängden läkemedel till respektive testbrunnar är en viktig del i detta experimentella inrättas. Innan du lägger ^{2: a} stadiet mygglarver till en 96-håls mikroplatta, kan varje larv sättas på en pappershandduk för 2-3 sek för att avlägsna överflödigt…

Materials

Name of the Reagent/Equipment	Company	Catalgue Number	Comments
96-well microplate	Fisher Scientific	12565561
Cell culture plate	CytoOne	CC7682-7506
Centrifuge	Sorvall Fresco	76003758	A different centrifuge can be used
Colored tape rolls	Fisher	S68134
Dissection microscope	Olympus	SZ
DTNB	Sigma Aldrich	D8130
DZNep.HCl	Sigma Aldrich	SMLO305
Egg dish cups
Filter papers	Fisher	09-795E
Glass feeders	Virginia Tech
Glass tissue homogenizer
Heating element	Fisher Scientific	NC0520091
Incubator	Percival scientific	I36VLC8	A different incubator can be used
Microcentrifuge tube,  2 ml	Axygen	22-283
Microcentrifuge tube, 1.5 ml	Axygen	MCT-150-C
Micropipette	Eppendorf	4910 000.069
Na2HPO4	Fisher Scientific	M-3154
NaH2PO4	Fisher Scientific	M-8643
pH meter	Mettler Toledo 7easy	S20
Plate reader	Spectramax	M2
SAH	Sigma Aldrich	A9384	store at -20C
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787