A protocol is developed to examine the effects of an epigenetic drug DZNep on the development, fecundity and survivorship of mosquitoes. Here we describe procedures for the aqueous exposure of DZNep to immature mosquitoes and a blood-based exposure of DZNep to adult mosquitoes in addition to measuring SAH hydrolase inhibition.
Insekticid resistens utgör ett stort problem för malariakontrollprogram. Myggor anpassa sig till ett brett spektrum av förändringar i miljön snabbt, vilket gör malaria styra en allestädes närvarande problem i tropiska länder. Framväxten av insektsresistenta populationer motiverar utforskandet av nya läkemedelsmål vägar och föreningar för vektormyggkontroll. Epigenetiska läkemedel är väl etablerade inom cancerforskningen, men inte mycket är känt om deras effekter på insekter. Denna studie ger ett enkelt protokoll för att pröva de toxikologiska effekterna av 3-Deazaneplanocin A (DZNep), en experimentell epigenetisk läkemedel för cancerbehandling, på malaria vektorn, Anopheles gambiae. En koncentrationsberoende ökning av mortaliteten och minskar i storlek observerades i omogna myggor exponerats för DZNep, medan föreningen reducerade fertiliteten hos vuxna myggor relativt kontrollbehandlingar. Dessutom fanns det en läkemedelsberoende minskning av S -adenosylhomocystein (SAH) hydrolasaktivitet i myggor efter exponering för DZNep jämfört med kontrollbehandlingar. Dessa protokoll ger forskaren med en enkel, steg-för-steg-förfarande för att bedöma flera toxikologiska endpoints för en experimentell drog och i sin tur, visar en unik multi stift strategi för att utforska de toxikologiska effekterna av vattenlösliga epigenetiska läkemedel eller föreningar av intresset mot vektor mygg och andra insekter.
Malaria är ansvarig för det högsta antalet insektsrelaterade dödsfall i världen. Uppskattningsvis 219 miljoner fall inträffar årligen i hela världen, vilket resulterar i cirka 660.000 dödsfall, främst i Afrika 1. Trots samordnade insatser, malariaprogram står inför flera utmaningar. Medan insecticidal behandlade bednets och indoor resterande besprutningen formulär nyckelkomponenter i programmet, resistens mot insekticider i lokala populationer hindra dessa ansträngningar 2. Den snabba ökningen av insektsresistenta myggpopulationer beror i hög utsträckning förmåga malariamyggor att snabbt anpassa sig till förändringar i sin miljö och utnyttja olika nischer 3,4,5. För att övervinna de befintliga mekanismerna för insektsresistens, är utforskandet av nya insekts mål och nästa generations föreningar motiverat. En enkel, steg-för-steg-protokoll för att bestämma effekten av experimentella insekticider på de olika stadierna av malaria mosquitoes skulle avsevärt förbättra dessa insatser.
Farmakologiska studier av läkemedelseffekter på cellinjer och djurmodeller har etablerat användningen av epigenetiska läkemedel som ett användbart verktyg för att modulera genetik och fysiologi av celler och organismer. DNA-metylering och histonmodifiering är två epigenetiska mekanismer som påverkar genuttryck i flercelliga organismer utan att ändra den underliggande DNA-sekvensen 6. Inlägg translationella modifieringar såsom metylering spelar en avgörande roll för att upprätthålla cellulär integritet och genuttryck, och kan påverka flera grundläggande processer 7,8,9. Forskning inom vissa insektsarter har lyft fram betydelsen av epigenetik i processer som involverar oogenes och stamcells underhåll 10, samt dosering kompensation 11. Men sådana aspekter i sjukdoms vektorer ännu på att utforskas. Med hjälp av en förening att modulera detta system myggor kan ge oss isevärdheter i de nya insektsmålgrupp vägar. 3-Deazaneplanocin A (DZNep) är en känd histon metylering hämmare, vilket påverkar olika typer av cancer har studerats 12,13,14,15,16. DZNep är en stabil vattenlöslig epigenetisk läkemedel som indirekt inhiberar histon lysin N -methyltransferase (EZH2), en komponent av Polycomb repressiva komplexet 2 (PRC2) i däggdjursceller. PRC2 spelar en viktig roll i regleringen av tillväxten av stamceller i flercelliga organismer, och histon metylering är en viktig aspekt av PRC2 medierad geners uttryck. I immunförsvagade möss, har celler som förbehandlats med DZNep visats vara mindre tumörframkallande 17. Detta läkemedel blir används för att studera andra sjukdomar, såsom alkoholfri fettlever, där EZH2 är inblandad 18. DZNep är en etablerad S -adenosylhomocysteine (SAH) hydrolas-hämmare 19, 20. Hämningen av SAH hydrolas resulterar i enansamling av SAH och i sin tur leder till hämning av metyltransferasaktivitet genom att begränsa tillgängliga metyl givargrupper. SAH är ett aminosyraderivat utnyttjas av många organismer, inklusive insekter, i deras metaboliska vägar. En färsk studie har visat att DZNep i låga doser kan påverka diapaus och fördröja utvecklingen av insekter 21.
Här är en robust protokoll för att undersöka effekterna av en vattenlöslig förening på olika livsstadier mygg utvecklas. De tre delarna av detta protokoll omfattar instruktioner för att undersöka effekterna av en vattenlöslig förening på omogna myggor, vuxna blod utfodring honor, och enzymaktiviteten hos vuxna manliga och kvinnliga myggor. Först DZNep löses i vatten för att studera omogna mygga utveckling och överlevnad. Detta utförs vid två koncentrationer för att jämföra skillnader som uppkommer från 10-faldig ökning av läkemedelsexponering. För att undersöka effekten av drogen på vuxna kvinnliga myggor, DZNepläggs till defibrilleras fårblod och matas blodet på konstgjord väg till honor. Därefter resultatet av drogen på fruktsamhet undersöktes. Slutligen en enzymaktivitetsanalys utförs med hjälp 5,5'-ditiobis- (2-nitrobensoesyra) (DTNB) som indikator för att bestämma effekten av DZNep på SAH hydrolas inhibition i vuxna manliga och kvinnliga myggor. Även om detta protokoll är utvecklad med ett malariamyggan, Anopheles gambiae, kan det enkelt anpassas till att studera effekterna av föreningar av intresse på alla arter av myggor eller andra insekter. De tekniker som beskrivs i detta protokoll får inte tillämpas effektivt till ett läkemedel med begränsad eller ingen löslighet i vatten eller vattenbaserade medier.
Det finns flera steg som är avgörande för en framgångsrik tillämpning av detta protokoll. För larver analysen, bör försiktighet iakttas för att korrekt märka och replikera varje testkoncentration. Randomisera testprover och lägga den utsedda mängden läkemedel till respektive testbrunnar är en viktig del i detta experimentella inrättas. Innan du lägger 2: a stadiet mygglarver till en 96-håls mikroplatta, kan varje larv sättas på en pappershandduk för 2-3 sek för att avlägsna överflödigt…
The authors have nothing to disclose.
We thank Victor Marquez for providing DZNep.HCl and Scotty Bolling for manufacturing the bloodfeeders. The Mopti and SUA2La strains of An. gambiae were obtained from the Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4). This work was supported by the Fralin Life Science Institute and the grant from National Institutes of Health 1R21AI094289 to Igor V. Sharakhov.
Name of the Reagent/Equipment | Company | Catalgue Number | Comments |
96-well microplate | Fisher Scientific | 12565561 | |
Cell culture plate | CytoOne | CC7682-7506 | |
Centrifuge | Sorvall Fresco | 76003758 | A different centrifuge can be used |
Colored tape rolls | Fisher | S68134 | |
Dissection microscope | Olympus | SZ | |
DTNB | Sigma Aldrich | D8130 | |
DZNep.HCl | Sigma Aldrich | SMLO305 | |
Egg dish cups | |||
Filter papers | Fisher | 09-795E | |
Glass feeders | Virginia Tech | ||
Glass tissue homogenizer | |||
Heating element | Fisher Scientific | NC0520091 | |
Incubator | Percival scientific | I36VLC8 | A different incubator can be used |
Microcentrifuge tube, 2 ml | Axygen | 22-283 | |
Microcentrifuge tube, 1.5 ml | Axygen | MCT-150-C | |
Micropipette | Eppendorf | 4910 000.069 | |
Na2HPO4 | Fisher Scientific | M-3154 | |
NaH2PO4 | Fisher Scientific | M-8643 | |
pH meter | Mettler Toledo 7easy | S20 | |
Plate reader | Spectramax | M2 | |
SAH | Sigma Aldrich | A9384 | store at -20C |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 |