Uttrykk for Fluorescent Proteiner i<em> Branchiostoma lanceolatum</em> Av mRNA Injeksjon i ubefruktet Oocytter
Summary
Vi rapporterer her den robust og effektiv uttrykk for fluorescerende proteiner etter mRNA injeksjon i ubefruktede eggceller av Branchiostoma lanceolatum. Utviklingen av mikroinjeksjon teknikk i denne basal chordate vil bane vei for vidtrekkende tekniske nyvinninger i denne nye modellen systemet, inkludert in vivo avbildning og genspesifikke manipulasjoner.
Abstract
We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the cephalochordate amphioxus, Branchiostoma lanceolatum. We use constructs for membrane and nuclear targeted mCherry and eGFP that have been modified to accommodate amphioxus codon usage and Kozak consensus sequences. We describe the type of injection needles to be used, the immobilization protocol for the unfertilized oocytes, and the overall injection set-up. This technique generates fluorescently labeled embryos, in which the dynamics of cell behaviors during early development can be analyzed using the latest in vivo imaging strategies. The development of a microinjection technique in this amphioxus species will allow live imaging analyses of cell behaviors in the embryo as well as gene-specific manipulations, including gene overexpression and knockdown. Altogether, this protocol will further consolidate the basal chordate amphioxus as an animal model for addressing questions related to the mechanisms of embryonic development and, more importantly, to their evolution.
Introduction
Under utviklingen gir en enkelt celle opphav til en hel organisme i en meget kompleks prosess som involverer både celledelinger og bevegelser. For bedre å forstå de biologiske prinsippene dynamikken i celle atferd, har utviklingsbiologer begynt å bruke fluorescens-basert in vivo imaging teknikker. Spesifikke avdelinger av celler, for eksempel cellemembraner, kan enten bli merket ved behandling med fluorescerende fargestoffer, en tilnærming hemmet av mangel på spesifisitet og vev penetrasjon 1, eller ved den spesifikke innføring i embryo av eksogene mRNA som koder for fluorescerende proteiner 2. Forskjellige teknikker kan brukes for effektiv levering av eksogene forbindelser, slik som mRNA. Disse inkluderer, men er ikke begrenset til, mikroinjeksjon, elektroporering, bombardement med mikropartikler, lipofeksjon, og transduksjon 3,4. Selv om alle disse fremgangsmåter kan brukes for å innføre eksogene forbindelser i enutvikling av embryo, tillater bare mikroinjeksjon anvendelsen av forhåndsdefinerte og presise mengder inn i hver celle 3. Mikroinjeksjon teknikker har blitt beskrevet for alle de store utviklingsmodellsystemer 4 (for eksempel fruktfluer, nematodeormer, sebrafisk, frosker, mus) samt for noen alternative modeller 4, inkludert de som brukes for sammenlignende studier med sikte på å forstå utviklingen av utviklingsmessige mekanismer (f.eks, sjøanemoner, annelid ormer, kråkeboller, ascidian kappedyr, den Lansettfisker amphioxus).
Cephalochordates, som sammen med kappedyr og virveldyr etablere chordate phylum, er spesielt godt egnet modeller for å studere utviklingen av chordatar og spredning av virveldyr fra en virvelløse stamfar 5-8. Den Lansettfisker avstamning avvek veldig tidlig i løpet chordate evolusjon; og bevarte cephalochordates, som er inndelt i tre slekter (Branchiostoma, Asymmetron og Epigonichthys), ligner virveldyr både i form av generelle anatomi og genom arkitektur 5-8. Av de ca 30 arter av cephalochordates som har blitt beskrevet så langt, fem er tilgjengelig for embryologiske og utviklingsstudier 6,9: Asymmetron lucayanum (Bahama Lansettfisker), Branchiostoma floridae (Florida amphioxus), Branchiostoma lanceolatum (den europeiske amphioxus), Branchiostoma belcheri (den kinesiske amphioxus) og Branchiostoma japonicum (den japanske amphioxus). Modne voksne i tre av disse artene (B. lanceolatum, B. belcheri og B. japonicum) kan induseres å gyte on-demand i hekkesesongen 10,11. I tillegg, i det minste for B. lanceolatum, kan effektiv gyting også bli indusert i kunstig sjøvann 12, og dermed gjør denne spesielle Lansettfisker arter tilgjengelig for laboratoriumtallet som ikke har tilgang til naturlig sjøvann. Kombinasjonen, i B. lanceolatum, av en praktisk og pålitelig tilgang til embryoer med en effektiv leveringsmetode, for eksempel mikroinjeksjon, så langt det eneste levering teknikk utviklet i amphioxus (i både B. floridae og B. belcheri) 13-15, vil muliggjøre utvikling av en roman suite av manipulerende teknikker, inkludert avstamning tracing- og dynamisk celleatferdsbaserte tilnærminger.
En protokoll for effektiv mikroinjeksjon av mRNA for å uttrykke fluorescerende proteiner i B. lanceolatum embryo ble derfor utviklet. Videre, for å gi en grunnleggende verktøykasse for levende avbildning av B. lanceolatum embryoer ble vektorsystemer utviklet som tillater membran-forbundet og kjernefysisk uttrykk for fluorescerende proteiner. For membran målretting, ble forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) smeltet til den menneskelige HRAS CAAX boksen og kjernefysiske lokalisering av mCherry og EGFP varoppnås ved fusjon til sebrafisk histone 2B (H2B) ekson (Figur 1, Supplerende Fil 1). Videre, med det mål å optimalisere protein oversettelse, de Kozak sekvenser og kodonene av konstruksjonene har blitt modifisert og tilpasset bruk i B. lanceolatum. Til sammen vil de injeksjon metode og ekspresjonsvektorene presenteres her tjene som grunnlag for generering av nye eksperimentelle tilnærminger for cephalochordates, særlig analyser bruker den nyeste fluorescens-basert in vivo imaging teknikker.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne artikkelen presenterer vi, for første gang, en detaljert og reproduserbar protokoll for injeksjon av B. lanceolatum eggceller, som etter B. floridae 13,14 og B. belcheri 15, er således den tredje amphioxus art, hvor en slik teknikk er beskrevet. Viktigere protokollen beskrevet her også omfatter beskrivelsen av vektorsystemer er egnet for produksjon av fluorescerende proteiner i B. lanceolatum fra injisert mRNA produsert in vitro (beskrevet ned…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke våre av "Animalerie Centrale de Gif-sur-Yvette" for dyrehold. Dette arbeidet ble støttet av midler fra ANR (ANR-09-BLAN-0262-02 og ANR-11-JSV2-002-01) til Michael Schubert, av EU FP6 stipend "Embryomics" og av ANR stipend "ANR- 10-BLAN-121801 Dev-Process "til Jean-François Nicolas og Nadine Peyriéras. João Emanuel Carvalho er finansiert av en FCT doc (SFRH / BD / 86878/2012).
Forespørsler om vektorene er beskrevet her kan rettes direkte til forfatterne.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Consumables | |||
| 35 mm Petri dishes | Falcon | 353001 | culture-treated |
| Filtration unit (Stericup 1L) | Fisher | W21719 | 0.22 micron filtration |
| Spin-X tubes | Costar | 8160 | 0.22 micron filtration tube |
| Needle storage jar for 1.2 mm diameter capillaries | WPI | E212 | |
| Pasteur Pipettes | 230 mm long | ||
| Aspiration tube | Dutscher | 75056 | |
| Capillaries for injection needles | Sutter | BF 120-94-10 | Borosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 mm |
| Reagents | |||
| Low-melting agarose | SIGMA | A9414 | |
| Phenol Red | SIGMA | 114537 | |
| Glycerol | SIGMA | G2025 | |
| Poly-L-Lysine hydrobromide | SIGMA | P9155 | |
| H2O Dnase, Rnase-free | Gibco | 10977-035 | |
| mMessage mMachine SP6 Transcription kit | Ambion | AM1340 | mRNA synthesis kit |
| Phenol pH8 | SIGMA | P4557 | |
| 24:1 chloroform:isoamylic alcohol | SIGMA | C0549 | |
| 5:1 phenol pH4.7:chloroform | SIGMA | P1944 | |
| Reef Crystal salts (200 kg) | Europrix | Commercial salts | |
| Equipment | |||
| Fluorescent dissecting scope with 200x magnification | Leica | MZ16F | 25x oculars, DSR and GFP2 filters |
| Micromanipulator | Marzhauzer | M-33 | |
| Injector | Picospritzer | model II or III | |
| Needle puller | Sutter | P97 | heating-filament needle puller |
| Fine forceps | FINE SCIENCE TOOLS GMBH | 11252-30 | Dumont #5 |
Referências
- Weber, T., Köster, R. Genetic tools for multicolor imaging in zebrafish larvae. Methods. 62, 279-291 (2013).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends. Cell. Biol. 20, 380-390 (2010).
- Zhang, Y., Yu, L. C. Microinjection as a tool of mechanical delivery. Curr. Opin. Biotechnol. 19, 506-510 (2008).
- Stepicheva, N. A., Song, J. L. High throughput microinjections of sea urchin zygotes. J. Vis. Exp. , e50841 (2014).
- Schubert, M., Escriva, H., Xavier-Neto, J., Laudet, V. Amphioxus and tunicates as evolutionary model systems. Trends Ecol. Evol. 21, 269-277 (2006).
- Bertrand, S., Escriva, H. Evolutionary crossroads in developmental biology: amphioxus. Development. 138, 4819-4830 (2011).
- Holland, L. Z. Evolution of new characters after whole genome duplications: insights from amphioxus. Semin. Cell Dev. Biol. 24, 101-109 (2013).
- Lemaire, P. Evolutionary crossroads in developmental biology: the tunicates. Development. 138, 2143-2152 (2011).
- Yu, J. K., Holland, L. Z. Cephalochordates (amphioxus or lancelets): a model for understanding the evolution of chordate characters. Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
- Fuentes, M., et al. Insights into spawning behavior and development of the European amphioxus (Branchiostoma lanceolatum). J. Exp. Zool. B. 308, 484-493 (2007).
- Li, G., Shu, Z., Wang, Y. Year-round reproduction and induced spawning of Chinese amphioxus, Branchiostoma belcheri, in laboratory. PLoS One. 8, e75461 (2013).
- Theodosiou, M., et al. Amphioxus spawning behavior in an artificial seawater facility. J. Exp. Zool. B. 316, 263-275 (2011).
- Holland, L. Z., Yu, J. K. Cephalochordate (amphioxus) embryos: procurement, culture, and basic methods. Methods Cell Biol. 74, 195-215 (2004).
- Holland, L. Z., Onai, T. Analyses of gene function in amphioxus embryos by microinjection of mRNAs and morpholino oligonucleotides. Methods Mol. Biol. 770, 423-438 (2011).
- Liu, X., Li, G., Feng, J., Yang, X., Wang, Y. Q. An efficient microinjection method for unfertilized eggs of Asian amphioxus Branchiostoma belcheri. Dev. Genes Evol. 223, 269-278 (2013).
- Harvey, K. J., Lukovic, D., Ucker, D. S. Membrane-targeted green fluorescent protein reliably and uniquely marks cells through apoptotic death. Cytometry. 43, 273-278 (2001).
- Maruyama, J., Nakajima, H., Kitamoto, K. Visualization of nuclei in Aspergillus oryzae with EGFP and analysis of the number of nuclei in each conidium by FACS. Biosci. Biotechnol. Biochem. 65, 1504-1510 (2001).
- Rupp, R. A., Snider, L., Weintraub, H. Xenopus embryos regulate the nuclear localization of XMyoD. Genes Dev. 8, 1311-1323 (1994).
- Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes Dev. 8, 1434-1447 (1994).
- Nakagawa, S., Niimura, Y., Gojobori, T., Tanaka, H., Miura, K. Diversity of preferred nucleotide sequences around the translation initiation codon in eukaryote genomes. Nucleic Acids Res. 36, 861-871 (2008).
- Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. Codon usage tabulated from international DNA sequence databases: status for the year 2000. Nucleic Acids Res. 28, 292 (2000).
- Deheyn, D. D., et al. Endogenous green fluorescent protein (GFP) in amphioxus. Biol. Bull. 213, 95-100 (2007).
- Schubert, M., et al. Retinoic acid signaling acts via Hox1 to establish the posterior limit of the pharynx in the chordate amphioxus. Development. 132, 61-73 (2005).
- Schubert, M., Holland, N. D., Laudet, V., Holland, L. Z. A retinoic acid-Hox hierarchy controls both anterior/posterior patterning and neuronal specification in the developing central nervous system of the cephalochordate amphioxus. Dev. Biol. 296, 190-202 (2006).
- Yu, J. K., Holland, N. D., Holland, L. Z. Tissue-specific expression of FoxD reporter constructs in amphioxus embryos. Dev. Biol. 274, 452-461 (2004).
- Beaster-Jones, L., Schubert, M., Holland, L. Z. Cis-regulation of the amphioxus engrailed gene: insights into evolution of a muscle-specific enhancer. Mech. Dev. 124, 532-542 (2007).
- Holland, L. Z., et al. The amphioxus genome illuminates vertebrate origins and cephalochordate biology. Genome Res. 18, 1100-1111 (2008).
- Urasaki, A., Mito, T., Noji, S., Ueda, R., Kawakami, K. Transposition of the vertebrate Tol2 transposable element in Drosophila melanogaster. Gene. 425, 64-68 (2008).
- Li, G., et al. Mutagenesis at specific genomic loci of amphioxus Branchiostoma belcheri using TALEN method. J. Genet. Genomics. 41, 215-219 (2014).
- Zhang, Q. J., et al. Continuous culture of two lancelets and production of the second filial generations in the laboratory. J. Exp. Zool. B. 308, 464-472 (2007).
- Yasui, K., Igawa, T., Kaji, T., Henmi, Y. Stable aquaculture of the Japanese lancelet Branchiostoma japonicum for 7 years. J. Exp. Zool. B. 320, 538-547 (2013).
- Benito-Gutiérrez, E., Weber, H., Bryant, D. V., Arendt, D. Methods for generating year-round access to amphioxus in the laboratory. PLoS One. 8, e71599 (1371).
