Skeletmuskel er afgørende for bevægelse og er organernes vigtigste protein butik. Muskel sundhed målinger inden for C. elegans er beskrevet. Potentielle ændringer i muskel struktur og funktion er vurderet ved hjælp af lokaliseret GFP og kationiske farvestoffer.
Muskel er en dynamisk væv, der reagerer på ændringer i ernæring, motion og sygdomstilstand. Tabet af muskelmasse og funktion med sygdom og alder er betydelige sundhedsmæssige byrder. Øjeblikket forstår vi lidt om den genetiske regulering af muskel sundhed med sygdom eller alder. Nematoden C. elegans er en etableret model for forståelse af den genomiske regulering af biologiske processer af interesse. Denne orm krop væg muskler vise en stor grad af homologi med musklerne i højere metazoan arter. Da C. elegans er en gennemsigtig organisme, lokaliseringen af GFP til mitochondrier og sarkomerer tillader visualisering af disse strukturer in vivo. Tilsvarende fodring af dyr kationiske farvestoffer, der akkumuleres baseret på eksistensen af en mitokondriemembranpotentiale, det muligt at vurdere mitokondriefunktionen in vivo. Disse metoder, samt vurdering af muskel protein homeostasis, er kombineret med vurdering af hele dyret muskelfunktion, i form af flytning assays, for at muliggøre korrelation af sub-cellulære defekter med funktionelle foranstaltninger muskel ydeevne. Således C. elegans giver en stærk platform med til at vurdere effekten af mutationer, gen knockdown, og / eller kemiske forbindelser ved muskel struktur og funktion. Endelig, som GFP, kationiske farvestoffer, og bevægelse assays vurderes non-invasivt, kan prospektive undersøgelser af muskel struktur og funktion udføres hele livet og dette på nuværende tidspunkt ikke let kan undersøges in vivo i en anden organisme.
Muskel er en multifunktionel væv, godt værdsat for sin rolle i bevægelse, postural støtte og stofskifte. Udvikling og vedligeholdelse af sund muskel kræver koordinering af flere cellulære processer og komponenter. Enten gennem skade eller sygdom, kan dysregulation forekomme, hvilket resulterer i ændret muskel struktur og / eller funktion. Age-associeret fald i muskelfunktion præsenterer en betydelig byrde for sundhedspersonale budgetter i den vestlige verden, da muskelmasse 1,2 og især muskelstyrke og udholdenhed 3-5 er negativt korreleret med dødelighed. Målingen af aspekter vedrørende forværrede muskel funktion såsom ændret mitokondriefunktionen eller sarkomeret forstyrrelser, kan give større forståelse af de mekanismer der ligger til grund overordnede muskel udvikling og sundhed.
C aenorhabditis elegans (C. elegans) er en mikroskopisk nematode best er kendt, fordi det var den første flercellede organisme har hele dets genom sekventeret 6, den første til at have gener tavshed ved hjælp af RNAi 7, og den eneste metazoan at have hele sin celle afstamning 8 og 9 neuroanatomien bestemt. C. elegans blev først foreslået som en model for studiet af den genetiske kontrol af adfærd i 1974 af Sydney Brenner 10 og betydningen af dette og efterfølgende arbejde blev anerkendt med den første af tre Nobelpriser tildeles C. elegans forskere. Ca. 35% af C. elegans gener er identificeret orthologer i mennesker, med C. elegans at være en vigtig organisme, der anvendes til at forstå den genetiske kontrol af muskeludviklingen 11. Næsten hver genet i C. elegans genomet kan blive slået ned gennem RNAi 7,12. Således ved at banke ned gener i fuldt udviklede muskler, genetiske komponenter bidrager til repå reguleringen af muskel sundhed kan undersøges med relative enkelhed 13.
Den kombinerede evne til at bruge RNAi, mutanter, og kemiske forbindelser, gør C. elegans et premier-system for at udforske den genetiske regulering 7,14,15 af muskel struktur og funktion med alderen 16 og i sygdomsmodeller 17. Kan måles virkningen af gen knockdown, mutation, og / eller udsættelse for kemiske forbindelser upon muskel struktur og / eller funktion gennem flere aspekter. Her beskriver vi kort enkle teknikker til vurdering af C. elegans muskel struktur og funktion, hvoraf mange kan anvendes i prospektive undersøgelser af muskel sundhed.
Udviklingen af grønt fluorescerende protein (GFP) 18 er aktiveret visualisering af både beliggenheden af specifikke proteiner og den generelle struktur af organeller i C. elegans. Her forklarer vi, hvordan GFP udtrykte speciudtrykkeligt er inden for kropsvæggen muskel mitokondrier, kan kerner eller sarkomerer anvendes til at bestemme, om dystrofi af disse sub-cellulære strukturer er til stede. Som struktur er ikke altid en pålidelig surrogat for funktion, har vi også forklare, hvordan anvendelsen af kationiske farvestoffer in vivo muligt at vurdere forringet mitokondriemembranpotentiale inden muskel. Når farvestofferne anvendes i kombination med GFP, de tillader arkitektur og funktion i en tidsmæssig måde i hele levetiden. Endelig er vi også forklare, hvordan protein homeostasen i muskel kan vurderes, og hvordan alle disse foranstaltninger kan bruges til at korrelere ændringer i hele dyret muskel sundhed via brug af bevægelse assays. Disse teknikker, kombineret med gen knockdown, mutationer og / eller kemiske forbindelser tilvejebringer et kraftfuldt arsenal for at undersøge, hvordan specifikke gener eller forbindelser påvirke muskel sundhed in vivo. De paralleller i struktur, metabolisme og grov funktion af musklen mellem C. elegans ogpattedyr betyde C. elegans er en fremragende model organisme for at forstå regulering af muskler i højere organismer, herunder mennesker.
Disse metoder tillader udforskning af muskel fra macrophysiology bevægelighed til at identificere subcellulære defekter, der er tilstrækkelig til at forårsage en bevægelse defekt. Når det kombineres disse metoder mulighed for en nærmere analyse af muskler. Indsigten tillader yderligere test af muskel-orienterede hypoteser, der vedrører almen fysiologi, patofysiologi og aldring.
Movement assays
En bevægelse defekt indikerer en afbrydelse af den normale neuromuskulære funktion. Dette kan være specifik for nerver eller muskler, eller det kan være fælles mellem flere væv. De mest vanskelige faser i gennemførelsen af bevægelse assays vælger orme, der er repræsentative for befolkningen og / eller behandling, og også sikre, at forsøgslederen ikke skade dyret ved overførsel til M9. Det er vigtigt at have en stor stikprøve størrelse for at opnå en repræsentativ og præcis vurdering af bevægelse. Når analyse stærkt penetrant effekter, for eksempel som ofte ses i mutanter, en stikprøve på ti dyr hver vurderede bevægelighed for ti gange er tilstrækkelig til at finde statistisk signifikante forskelle i forhold til vildtype. Men enkelheden i bevægelse assays og nem dyrkning C. elegans betyder, at hundredvis af orme hurtigt kan vurderes med henblik på at sikre kvantitativt robuste resultater. Når analyse virkninger, der vises kun til stede i en del af en befolkning er det vigtigt at fastslå, hvilken del af befolkningen synes at være påvirket såvel som alvorligheden af fejl i de angrebne dyr. I sådanne situationer bør vurderes med henblik på at tilvejebringe de minimale data for andelen af befolkningen, der rammes større antal dyr. Ofte både narkotika og RNAi behandlinger vil producere alvorlige defekter bevægelse i en lille del af befolkningen. I visse tilfælde at øge dosis af behandling og eller metoden til levering vil øge andelen af affected dyr og kører Dosisresponskurver kan være nyttig til at bestemme den optimale koncentration af et lægemiddel eller RNAi. En anden begrænsning af denne bevægelse assay er, at ormene er manipuleret til at vurdere bevægelse. Således er ormene både stimuleret og udsat for en vis grad af osmotisk stress, når plukket i væske. Graden af osmotisk stress kan begrænses ved hjælp af M9 eller BU buffer 19 i modsætning til vand. Nogle af disse begrænsninger afhjælpes ved at måle sædvanlige bevægelse på plader ved hjælp af kommercielt tilgængelige sporingssystemer 34 eller gratis plug ins for ImageJ 35. Måling af bevægelse på et dyr kan give vigtige oplysninger om den samlede muskel sundhed, herunder ændringer i funktion, der kan måles i hele levetiden og ikke-invasiv, ved denne metode er nøglen til potentielle livslange studier af muskel funktion.
Billeddannelse af kontraktile Apparat
<p class = "jove_content"> Ormen stamme bruges her til apparatur billede kontraktile struktur var PJ727 36, der udtrykker et myosin GFP-fusion protein, der er lokaliseret til sarkomerer i kroppen væg muskler. Anvendelse af denne stamme muliggør visualisering af sarkomer struktur i levende dyr. Svarende til bevægelse beskrevet ovenfor, en vigtig fordel ved anvendelse af GFP-mærkede sarkomerer at vurdere sarkomer struktur er, at fremgangsmåden er relativt ikke-invasiv og kan derfor anvendes til fremadrettet følge sarkomer struktur hos det enkelte dyr i hele levetiden. Den største vanskelighed ved denne metode er, at de orme, der er afbildet, er stadig i live og derfor bevæger sig, hvilket gør det vanskeligt at få godt fokuserede billeder. Adskillige fremgangsmåder kan anvendes til at reducere og foretager imaging enklere; disse omfatter bedøve eller lamme orme og immobilisering via tryk, suges eller brug af en høj viskositet løsning. Hver af disse metoder til immobilization har den ulempe, at det selv kan ændre neuromuskulære funktion. Derfor er det vigtigt at medtage passende ubehandlede kontroller i analysen. Det kan også være hensigtsmæssigt at anvende mindst to uafhængige fremgangsmåder til immobilisering for at bekræfte resultaterne ikke skyldes problemer med immobiliseringsmetode, afhængigt af hvor meget udbredt immobiliseringen metode er valgt for spørgsmålet under undersøgelsen. Her har vi brugt simpel pres fra dækglasset på ormen at medføre nedsat bevægelse. Efter placering af dækglasset, vil væsken under dækglasset fordampe og dækglasset vil derfor begynde at producere mere pres på orme, typisk det tager 2-5 min at producere nok reduceret bevægelse for at muliggøre let billeddannelse.Det er vigtigt at overvåge orme nøje efter dækglasset er blevet indført som trykket i sidste ende vil forøge nok til at forårsage orme at sprænge fra overdrevent tryk, typisk 10-15 minutter efter coverslip tilføjelse. Yderligere puffer kan indføres ved hjælp af en pipettespids omkring kanterne af dækglasset for at undgå knusningsbeskadigelse til orme. Neglelak kan anvendes til at forsegle kanten af dækglasset og forhindre fordampning, selv om dette forhindrer udtagning af dyr under dækglasset, hvis det ønskes. Tilsvarende kan anvendelsen af silikone perler i opløsningen at reducere mængden af tryk dækglasset steder på orme.
Ligesom med at vurdere for en bevægelse defekt, er det vigtigt at overveje penetransen virkning. Penetrans kan betragtes som høj, hvis 80-100% dyrene vise en fænotype på NGM plade, delvis, hvis 21-79%, og lav, hvis ≤20% af displayet befolkning en indvirkning. For stærkt penetrerende effekter, kan mindre stikprøvestørrelser bruges til at producere betydelige kvantitative data om sarkomeret defekter. I tilfælde, hvor effekten har en lav penetrans, udvælgelse af dyr, der viser en klar bevægelse defekt som reaktion på medicineller RNAi behandling kan være nyttige i at analysere sarkomeret defekter hos dyr er hårdest ramt af behandlingen. Det er imidlertid ikke nødvendigvis tilfældet, at omfanget af behandlingseffekt ved bevægelse og subcellulære struktur er den samme. Det kan således være ønskeligt at undersøge omfanget af defekter til stede i en stor population, for eksempel 100 dyr. Dette muliggør forståelse af fordelingen af fejl i løbet af en population. Det kan også være ønskeligt at undersøge omfanget af defekten i de hårdest ramte dyr og / eller undersøge sammenhængen mellem omfanget af sarkomer defekt og omfanget af bevægelse defekt. Potentielle vanskeligheder til side, denne metode er hurtigere og nemmere end andre metoder til vurdering sarkomeret struktur. Denne hastighed og brugervenlighed er dog underlagt en vigtig begrænsning, sarkomerer indeholder GFP fusionsproteiner er ikke helt normal 37 og dermed vurdering af sprængte sarkomerer skal bekræftes ved brug af yderligere mere arbejdskraftintensive metoder.Disse fremgangsmåder indbefatter anvendelse af polariseret lys 38, phalloidin farvning 39 og indirekte immunfluorescens 40. Af disse metoder kun polariseret lys er relativt ikke-invasiv; de andre metoder kræver fiksering og derfor ikke kan anvendes i prospektive undersøgelser af de enkelte dyr, snarere at de kun kan anvendes til at bekræfte, i tværsnit, resultaterne fra disse undersøgelser.
Imaging mitokondrie Networks
Ormen stamme anvendes til mitokondrielle billeddannelse eksperimenter var CB5600 7, som udtrykker et GFP-fusionsproteinet lokaliseret til mitokondrierne, og et GFP β-galactosidase-fusionsprotein lokaliseret til kernerne, både i kropsvæggen muskler. Som med anvendelsen af PJ727 for billeddannende sarkomerer, anvendelsen af denne stamme muliggør visualisering af mitokondrie netværksstruktur i levende dyr. Således kan denne stamme anvendes til at vurdere dynamiske forandringer, der sker, for eksempel reduceret mitochondrial fusion og / eller øget mitokondrie fission 41. Også som for billeddiagnostiske sarkomerer, den største vanskelighed ved denne metode er, at ormene bliver afbildet stadig er i live og bevæger sig, hvilket gør det vanskeligt at få godt fokuserede billeder. Mens adskillige fremgangsmåder, som beskrevet mere detaljeret ovenfor, kan anvendes til at reducere bevægelse, mitokondrier synes særligt følsomme over for indgreb, som inducerer reduceret bevægelse. For eksempel, mest almindeligt anvendte bedøvelsesmidler målkomponenter i mitokondrie respiratoriske kæde og skal derfor anvendes med forsigtighed i undersøgelser af normal mitokondrie struktur og funktion. Ligeledes skal de fleste paralytisk midler anvendes med forsigtighed i undersøgelser af normal mitokondrie struktur og funktion, som de fleste paralytisk midler forårsager mindre signal at passere gennem den neuromuskulære junction og funktionel denervering af musklen er tilstrækkelig til at inducere mitokondrie fragmentering. Forsøgene i denne undersøgelse anvendte tryk for at immobilisere dyrs men andre har med held brugt levamisol 42, selv om det er vigtigt at billedet dyr straks.
Endelig forskellige bakterielle forureninger i kulturer, for eksempel B. subtilis, kan inducere mitokondrie fragmentering; derfor er det vigtigt at medtage passende ubehandlede kontroller i analysen. For stærkt penetrerende effekter, kan mindre stikprøvestørrelser bruges til at producere betydelige kvantitative data om mitokondrie netværk defekter. Men på grund af forekomsten af mindre defekter i mitokondrie netværk, vil sandsynligvis være det dobbelte af antallet nødvendige for vurdering af sarkomer struktur dette lille antal dyr. I tilfælde, hvor effekten har en lav penetrans, kan udvælgelsen af dyr klart udviser en bevægelse defekt som reaktion på medicin eller RNAi behandling være nyttige i at analysere mitokondrie defekter hos dyr er hårdest ramt af behandlingen. Som nævnt ovenfor, er det imidlertid ikke nødvendigvis tilfældet, atomfanget af behandling effekt på bevægelse og subcellulære struktur er den samme. Det kan således være ønskeligt at undersøge omfanget af defekter til stede i en stor population, for eksempel 150-200 dyr, såvel som omfanget af forstyrrelser i de hårdest ramte dyr og nærvær eller fravær af omfanget af forstyrrelser med omfanget af defekt bevægelse. Andre stammer med fluorescensmærkede mitokondrier kan bruges til at bekræfte resultaterne opnået i CB5600, dog kan anvendelsen af forskellige fluorescerende proteiner påvirke baseline netværk af mitokondrier. For eksempel anvendelse af en Tomm-20 RFP fusion protein at visualisere mitokondrier synes at medføre øget baseline mitokondrie fragmentering i forhold til anvendelsen af mitokondrier lokaliseret GFP 17. Mens kan anvendes andre metoder, såsom immunofluorescens og elektronmikroskopi for at vurdere mitokondriestruktur, behøver de ikke give in vivo vurdering af mitokondrielle dynamik, fordi en fiksering trin er kræverd. Andre metoder såsom anvendelse af mitokondrier lokaliserede farvestoffer kan anvendes uden fiksering og kan derfor også anvendes i stedet for anvendelse af mitokondrier lokaliseret GFP. Som omtalt i næste afsnit, brug af sådanne farvestoffer tillader også rå vurdering af in vivo mitokondriefunktion.
Vurdere mitochondriemembran potentiale in vivo i C. elegans
En række farvestoffer er tilgængelige til mærkning af mitokondrier 28. Disse farvestoffer tilvejebringer en alternativ metode til at visualisere mitokondrie netværksstruktur i levende C. elegans. Mange af disse farvestoffer også tillade rå vurdering af mitochondrial funktion in vivo, fordi de ophobes i mitokondrier baseret på det mitokondrielle membranpotentiale. Her har vi brugt C 32 H 32 Cl 2 N 2 O, der indtages gennemfordøjelseskanalen, med nogle yderligere ind ormen via kutikula grund af permeabilisering gav ved at blive opløst i 0,5% DMSO. Efter indgang i cellen C 32 H 32 Cl 2 N 2 O oxideres og afsondres af mitokondrier, hvor det binder svovlholdige aminosyrer (f.eks methionin og cystein). Dannelsen af disse farvestof-peptid-komplekser betyder C 32 H 32 Cl 2 N 2 O forbliver i mitokondrierne, når mærket 28. Et centralt vanskelighed med anvendelse af mitokondrielle farvestoffer er, at de vil mærke alle mitokondrier i dyret. Derfor har vi udført mærkning i CB5600, den samme stamme, der er beskrevet ovenfor for vurdering af muskel mitokondrie netstruktur. Ved hjælp af en rød mitokondrie farvestof, en stamme af orme, der udtrykker GFP i muskel mitokondrier, og en tredobbelt pass filter, det er relativt ligetil at billedet kun mitokondrier i muskel ved at finde mitokondrier, der ovifte af co-lokalisering af rødt farvestof og GFP mærkede mitokondrier. Den sværeste trin i udførelsen af denne colokalisering fremgangsmåde er imaging fordi farvestoffet er tilgængeligt bleget inden for sekunder under høj intensitet fluorescerende lys. Denne virkning kan begrænses ved at holde fluorescens på lav effekt indtil forsøgslederen er klar til billede og derefter justere fluorescensintensiteten i overensstemmelse hermed. Når man er erfaren med brugen af farvestoffer anden tilgang er at udnytte konfokalmikroskopi med Z-stakke til billede kun mitokondrier i den rigtige væv; de mitokondrielle netværk i muskulatur er helt adskilt i forhold til andre væv. Desværre manglende evne til C 32 H 32 Cl 2 N 2 O forlade mitokondrier 28 betyder, at i modsætning til sarkomer og mitokondrie billeddannende teknikker diskuteret ovenfor, kan det ikke anvendes til fremadrettet følge tab af mitokondriefunktion med tiden, medmindre C 32 H 32 Cl 2 N 2 Otilsættes ved diskrete tidspunkter til at adskille dyrepopulationer. Denne begrænsning kan overvindes ved at anvende farvestoffer, såsom JC-10 at gøre forlade mitokondrierne ved sammenbrud af membranpotentiale 43. Mitokondrier kan også isoleres fra C. elegans 30 for efterfølgende biokemiske analyser. Sådan ekstraktion tillader kvantificering af mitokondriemembranpotentiale ved at kvantificere antallet af lipofile kationiske farvestof optagelse ved anvendelse af flowcytometri eller en fluorescerende pladelæser 44. Efter at have etableret en svækket mitokondriemembranpotentiale, er det også muligt at fastslå, om tabet af proton gradient udslag i et tab af ATP-produktion ved anvendelse af en følsom bioluminometric luciferase-baserede metode 45.
Vurdering af proteinnedbrydning i C. elegans
Ormen stamme anvendes her til at vurdere muskel proteinnedbrydning var PD55, som indeholder en muskel specifik βgalactosidase der konstant dannes gennem udvikling indtil voksenalderen er nået, og som forbliver stabil i cytosolen for de næste 72-96 timer 19. Således måling af β-galactosidase-niveauer under udviklingen overvejende angiver effekten af interventioner på syntese fra myosin promotoren hvorimod tab af β-galactosidase i voksenalderen indikerer et indgreb har udløst en øget cytosolprotein nedbrydning 19. Det afgørende skridt i vurderingen af β-galactosidase aktivitet er at sikre en effektiv tørring. Lykkes det ikke at udtørre dyr resulterer i dårlig bestemmelse af X-gal-substrat og derfor ringe blå farve i kroppen væg muskler af dyr. For at sikre en god udtørring forseglingen på ekssikkatoren skal kontrolleres, og prøven bør kontrolleres med 5-10 minutters intervaller hele udtørring at vurdere fremskridt (dvs. 20 pi prøve skulle have tørret inden for 10 minutter, og de resterende 20 miner at sikre en omfattende udtørring). Den β-galactosidase assay er en aktivitet assay derfor en passende kontrol er afgørende. Derudover faldt farvning af voksne i en behandling tilstand i forhold til at kontrollere beviser ikke, at nedbrydningen sker; snarere indikerer reduceret enzymatisk aktivitet i respons på behandlingen. For at bekræfte nedbrydning, skal mere arbejdskrævende western blot analyse blive afsluttet med en β-galactosidase 13 og dette giver mulighed for kvantificering proteinnedbrydning i små populationer af optalte orme. Western blot band tætheder kan kvantificeres ved hjælp ImageJ 46. En anden begrænsning ved denne metode er, at anvendelsen af transgene proteiner ikke oplyser, at fysiologiske mål for nedbrydning og for sådanne svar proteom og / eller målrettede hypotesebaseret western blots skal anvendes 13. Endelig da syntesen af de transgene proteiner anvendt i disse undersøgelser slukker i den tidlige voksenalder 19 </sup>, skal andre fremgangsmåder anvendes, når det ønskes at undersøge ændringer i proteinsyntese i fuldt udviklede C. elegans muskel; for eksempel, stabile og radioaktive isotop metoder.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a grant from the US National Institutes of Health National Institute for Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (AR-054342) to NJS. CJG was funded by a Doctoral training studentship funded by the University of Nottingham. JJB was funded by an MRC Doctoral training award (J500495). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
MitoTracker Red CMXRos (C32H32Cl2N2O) | Invitrogen | M-7512 | Red mitochondrial dye which accumulates based on a negative membrane potential |
DMSO | Thermo Scientific | 67-63-5 | |
KH2 PO4 | Sigma | 7778-77-0 | |
Na2HPO4 | BDH | 301584L | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
MgSO4 | Sigma | M-7506 | |
Microscopy Slides | Starfrost | K220 | |
Microscopy Cover Slips | VW2 International | 631-0124 | |
1.5ml Eppendorph Tubes | Fisher Scientific | FB74031 | |
Dessicator | Nalgene | D2672 | |
Nikon Microscope | Nikon | H600L | Nikon H600L microscope with proprietary software |
Nikon Camera | Nikon | DS-Fi1 | Nikon Digital Sight DS-Fi1 digital camera |
Zeiss Microscope | Zeiss | Ax10 | Zeiss AX10 microscope with an Axiocam MRC digital camera and Axiovision LE software and a triple-pass filter |
Plates 9cm | Starstedt | 82-1473 | |
Plates 6cm | Gosselin | BP53-01 | |
Potassium Ferrocyanide | Sigma-Aldrich | 14459-95-1 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
Na3PO4 | Sigma-Aldrich | 7601-54-9 | |
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside | Sigma-Aldrich | 7240-90-6 | |
N,N8-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 68-12-2 | |