Скелетных мышц имеет важное значение для передвижения и является основным магазин белок органов. Измерения здоровья мышц внутри C. Элеганс описаны. Предполагаемые изменения в структуре и функции мышц оцениваются с использованием локализованного GFP и катионные красители.
Мышцы это динамичная ткань, которая реагирует на изменения в питании, физических упражнений и болезненного состояния. Потеря мышечной массы и функции с болезнью и возраста значительные тяготы здравоохранения. В настоящее время мы понимаем, немного о генетической регуляции здоровья мышц с заболеванием или возрастом. Нематода C. Элеганс является признанным образцом для понимания геномной регуляции биологических процессов, представляющих интерес. Стенки тела мышцы этот червь отображают большую степень гомологии с мышц высших многоклеточных видов. Поскольку C. Элеганс является прозрачным организм, локализация GFP в митохондриях и саркомерах позволяет визуализировать этих структур в естественных условиях. Аналогичным образом, кормление животных катионные красители, которые накапливаются на основе существования митохондриальной мембранного потенциала, позволяет оценить митохондриальной функции в живом организме. Эти методы, а также оценка из мышечного белка homeostaSIS, в сочетании с оценкой всей животной мышечной функции, в виде движения анализов, чтобы позволить корреляцию субклеточных дефектов с функциональных показателей эффективности мышц. Таким образом, С. Элеганс представляет собой мощную платформу, с помощью которой для оценки влияния мутаций, генной нокдаун, и / или химических соединений на структуру и функции мышц. И, наконец, как GFP, катионных красителей, а движение анализов оцениваются неинвазивно, перспективные исследования структуры и функции мышц может быть проведена на всей жизни, конечно, и это в настоящее время не могут быть легко исследованы в естественных условиях и в любом другом организме.
Мышцы это многофункциональный ткани, хорошо оценили за его роль в двигательной, постуральной поддержки и обмена веществ. Развитие и поддержание здорового мышцы требует координации нескольких клеточных процессов и компонентов. Либо через повреждение или болезнь, нарушение регуляции может произойти, в результате чего измененной структурой и / или мышечной функции. Связанное с возрастом снижение функции мышц представляет собой значительную нагрузку на бюджеты здравоохранения в западном мире, так как мышечная масса 1,2 и особенно мышечная сила и выносливость 3-5 отрицательную корреляцию со смертностью. Измерение аспектов, связанных с ухудшением функции мышц, такие как измененное митохондриальной функции или нарушения саркомера, может позволить большее понимание механизмов, лежащих в основе общего развития и здоровья мышц.
С aenorhabditis Элеганс (C. Элеганс) является микроскопические нематоды бест известно, потому что это был первый многоклеточный организм, чтобы иметь весь его геном последовательность 6, первый есть гены замолчать с помощью РНК-интерференции 7, и только метазоа иметь свои Вся клональные клеток 8 и нейроанатомии 9 определяется. C. Элеганс впервые была предложена в качестве модель для изучения генетического контроля поведения в 1974 году Сидней Бреннер 10 и важности этого и последующих работ была признана с первым из трех Нобелевских премий, присужденных C. Элеганс исследователей. Около 35% C. Элеганс гены определили ортологи в людях, с C. Элеганс является ключевым организм используются для понимания генетического контроля развития мышц 11. Почти каждый ген в C. Элеганс генома может быть сбит с помощью РНК-интерференции 7,12. Таким образом, сбивая генов в полностью развитой мышцы, генетические компоненты вклад в реgulation здоровья мышц могут быть исследованы с относительной простотой 13.
Комбинированный Возможность использования RNAi, мутанты, и химические соединения делает C. Элеганс ведущим системы для изучения генетической регуляции 7,14,15 структуры и функции мышц с возрастом 16 и в моделях болезни 17. Воздействие генной мутации нокдауна, и / или воздействием химических соединений от структуры и / или функции мышц может быть измерена с помощью нескольких аспектах. Здесь мы кратко опишем простые методы для оценки C. Элеганс структуру и функцию мышц, многие из которых могут быть использованы в перспективных исследований здоровья мышц.
Развитие зеленого флуоресцентного белка (GFP), 18 позволила визуализировать как местности специфических белков и общей структуры органелл в C. Элеганс. Здесь мы объясним, как GFP выразил специфичнуюfically в тела стены мышц митохондрий, ядра, или саркомеры может использоваться для определения того, дистрофия этих субклеточных структур присутствует. Как структура не всегда является надежным суррогатом функции, мы также объяснить, как использование катионных красителей в естественных условиях позволяет оценить нарушения митохондриального мембранного потенциала в мышцах. Когда красители используют в сочетании с GFP, они позволяют изучать архитектуру и функции в височной образом на протяжении срока службы. Наконец, мы также объяснить, как белка гомеостаз в мышцах может быть оценена и как все эти меры могут быть использованы для корреляции изменения в целый здоровья мышц животных посредством использования движения анализов. Эти методы, в сочетании с генной мутации, нокдаун, и / или химических соединений обеспечивают мощный арсенал для изучения того, как специфические гены или соединения влиять на здоровье мышц в естественных условиях. Параллели в структуре, метаболизме и валового функции мышцы между C. Элеганс имлекопитающие значит С. Элеганс представляет собой выдающийся пример организм для понимания регулирование мышцы у высших организмов, включая человека.
Эти методы позволяют разведку мышцы от macrophysiology движения для идентификации субклеточных дефекты, которые достаточно, чтобы вызвать дефект движения. В сочетании эти методы позволяют детальный анализ мышцы. Понимание получила позволяет дальнейшее тестирование мышц-ориентированных гипотез, относящихся к общей физиологии, патофизиологии и старения.
Движение Анализы
Дефект движение указывает на нарушение нормальной нервно-мышечной функции. Это могут быть специфическими для нервов или мышц, или он может быть общим между несколькими тканей. Самые трудные этапы комплектующих анализов движения выбираете червей, которые являются репрезентативными для населения и / или лечения, а также обеспечение того, чтобы экспериментатор не травмировать животное при переходе на М9. Важно иметь большой размер выборки, чтобы получить представительную и точную оценку движения. Когда анализируя высоко пероetrant эффекты, например, как часто можно увидеть в мутантов, размер выборки из десяти животных каждый оценивается для движения в десять раз достаточно найти статистически значимых различий в сравнении дикого типа. Тем не менее, простота анализов движения и легкости культивирования C. Элеганс означает, что сотни червей быстро можно оценить с тем чтобы обеспечить количественно надежные результаты. Когда анализируя эффекты, которые появляются присутствует только в части популяции важно, чтобы определить, какая часть населения по-видимому, будут затронуты, а также от тяжести дефекта в наиболее пораженных животных. В таких ситуациях большее число животных должна быть оценена, чтобы обеспечить минимальные данные для части населения пострадавших. Часто оба препарата и РНК-интерференции лечения будет производить тяжелые дефекты движения в небольшой части населения. В некоторых случаях увеличение дозы лечения и или способа доставки будет увеличивать долю AFFected животные и кривые зависимости ответа от дозы бег может быть полезен при определении оптимальной концентрации лекарственного средства или РНК-интерференции. Второе ограничение этого движения анализе является то, что черви манипулировать, чтобы оценить движение. Таким образом, черви и стимулируется и подвергают какой-то степени осмотического стресса при получении в жидкость. Степень осмотического стресса может быть ограничен с помощью M9 или BU буфера 19, в отличие от воды. Некоторые из этих ограничений смягчаются путем измерения привычный движение на пластинах с использованием коммерчески доступных системы слежения 34 или бесплатные плагины для ImageJ 35. Измерение скорости движения животного могут предоставить важную информацию о здоровье в целом мышц, в том числе изменения в функции, которые можно измерить на протяжении всей жизни и не-инвазивность этого метода является ключевым для потенциальных пожизненных исследований функции мышц.
Визуализация сократительного аппарата
<р класса = "jove_content"> Штамм червь используется здесь для структуры изображения сократительного аппарата был PJ727 36 выражающее миозина GFP слитый белок, который ограничен к саркомерах в стенки тела мышц. Использование этого штамма позволяет визуализировать структуры саркомера в живых животных. Аналогично движению анализа, описанного выше, ключевым преимуществом использования GFP помечены саркомеры оценить структуру саркомера является то, что метод является относительно неинвазивным и, следовательно, может быть использован для перспективно следовать структуру саркомера в отдельных животных на протяжении всей жизни. Наибольшую трудность этого метода является то, что черви, которые изображаемого живы и поэтому движется, что делает его трудно получить хорошо сфокусированные изображения. Несколько методов могут быть использованы, чтобы уменьшить движение и сделать более простым визуализации; они включают обезболивающее или парализует червей и иммобилизации через давление, всасывания или использованием высокой решения вязкости. Каждый из этих методов immobilizция имеет тот недостаток, что он может сам изменять нервно-мышечную функцию. Таким образом, крайне важно, чтобы включать в себя соответствующие необработанными контрольными в анализе. Он также может быть целесообразно использовать по крайней мере два независимых методов иммобилизации, чтобы подтвердить результаты не из-за проблем с методом иммобилизации, в зависимости от того, как широко используемый метод иммобилизации выбранные для изучаемого вопроса. Здесь мы использовали простой давление от покровного стекла на червя, чтобы вызвать пониженное движение. После размещения покровное, жидкость под покровным испарится и покровное будет, следовательно, начинают производить больше давление на червей, как правило, это занимает 2-5 минуты, чтобы произвести достаточное снижение движение, чтобы позволить легкий изображений.Важно следить за червей тесно после покровное была введена как давление в конечном итоге увеличить достаточно, чтобы вызвать червей лопнуть от избыточного давления, как правило, 10-15 минут после сотрудничестваverslip дополнение. Дополнительная буфера могут быть введены с помощью наконечника пипетки вокруг краев покровного стекла, чтобы избежать травм на раздавливание червей. Окрашивание ногтей может быть использован для герметизации краев покровным стеклом и предотвратить испарение, хотя это предотвращает извлечение животных из-под покровным стеклом, при желании. Точно так же, использование силиконовых шариков в растворе может помочь уменьшить количество давлением покровного места на червей.
Так же, как с оценкой за дефекта движения, важно рассмотреть пенетрантность эффекта. Пенетрантность можно считать высокой, если 80-100% животных отображения фенотип на NGM пластины, частичное если 21-79% и низкой, если ≤20% от дисплея населения влияет. Для сильно проникающих эффектов, меньшие размеры выборки могут быть использованы для производства значительных количественных данных о саркомера дефектов. В тех случаях, когда эффект имеет низкую пенетрантность, выбор животных, что четкое отображение дефект движение в ответ на лекарстваили лечение RNAi, могут быть полезны в опробования саркомера дефекты у животных, наиболее пострадавших от лечения. Тем не менее, это не обязательно так, что степень эффективности лечения на движения и субклеточном структуре такой же. Таким образом, может быть желательно, чтобы исследовать степень дефектов, присутствующих в большой популяции, например 100 животных. Это дает возможность понимания распределения дефектов по всей популяции. Он также может быть желательно, чтобы изучить степень дефекта в наиболее пострадавших животных и / или изучить корреляцию между степенью саркомера дефекта и степени дефекта движения. Потенциальные трудности в сторону, этот метод быстрее и проще, чем другие методы оценки структуры саркомера. Эта скорость и легкость, однако, при условии ключевого ограничения, саркомеры слитые белки, содержащие GFP не совсем нормально 37 и, следовательно, оценка разрушенных саркомеров должен быть подтвержден с использованием дополнительных более трудоемких методов.Эти методы включают в себя использование поляризованного света 38, фаллоидином окрашивания 39 и непрямой иммунофлюоресценции 40. Из этих методов, только поляризованный свет является относительно неинвазивным; другие методы требуют фиксации и, следовательно, не могут быть использованы в перспективных исследований отдельных животных, а они могут быть использованы только для подтверждения, пересекают сечении, результаты таких исследований.
Визуализация митохондриальных Networks
Штамм червь используется для митохондриальных экспериментов было визуализации CB5600 7, который выражает GFP слитый белок локализован в митохондриях и GFP β-галактозидазы слитого белка, локализованного в ядрах, как в теле стеновых мышц. Как с использованием PJ727 для визуализации саркомерах, использование данного штамма позволяет визуализировать митохондриальной структуры сети в живых животных. Таким образом, этот штамм может быть использован для оценки динамических изменений, которые происходят, например, снижается mitochondrial слияние и / или увеличение митохондрий деления 41. Также как и для визуализации саркомерах, самая большая трудность при этом способе является то, что черви изображаемого живы и перемещения, что делает его трудно получить хорошо сфокусированные изображения. В то время как несколько методов, как описано более подробно выше, могут быть использованы, чтобы уменьшить движение, митохондрии появляются особенно чувствительны к вмешательств, которые индуцируют уменьшенную движение. Например, наиболее часто используемый анестетики целевые компоненты дыхательной цепи митохондрий и, следовательно, должны использоваться с осторожностью в исследованиях нормальной митохондриальной структуры и функции. Точно так же большинство паралитические агенты должны использоваться с осторожностью в исследованиях нормальной митохондриальной структуры и функции, как большинство паралитические агенты вызывают меньше сигнал проходит через нервно-мышечного соединения и функциональной денервации мышцы достаточно, чтобы вызвать митохондриальную фрагментации. Эксперименты в этом исследовании использовали давление, чтобы иммобилизовать животноеS, но другие успешно использован левамизол 42, хотя это имеет важное значение для изображения животных сразу.
Наконец, различные бактериальные загрязняющие вещества в культурах, например Б. Сенная, может вызвать митохондриальную фрагментации; Поэтому очень важно, чтобы включить соответствующие необработанные управления в анализе. Для сильно проникающих эффектов, меньшие размеры выборки могут быть использованы для производства значительные количественные данные о сетевых митохондриальных дефектов. Тем не менее, из-за распространенности незначительными дефектами в митохондриальной сети, это небольшое количество животных, вероятно, будет в два раза больше количества, необходимого для оценки структуры саркомера. В тех случаях, когда эффект имеет низкую пенетрантность, выбор животных четко отображать дефект движение в ответ на лекарства или лечения RNAi, могут быть полезны в опробования митохондриальные дефекты у животных, наиболее пострадавших от лечения. Тем не менее, как упоминалось выше, это не всегда так, чтоСтепень эффекта лечения на движения и субклеточном структуре такой же. Таким образом, может быть желательно, чтобы изучить степень дефектов, имеющихся в большой популяции, например 150-200 животных, а также степень нарушения в наиболее сильно пострадавших животных и наличие или отсутствие степени нарушения со степенью дефект движение. Другие штаммы с флуоресцентно меченый митохондрий может быть использована, чтобы подтвердить результаты, полученные в CB5600, однако, использование различных флуоресцентных белков могут влиять на базовой сети митохондрий. Например, использование Томма-20 RFP слитого белка для визуализации митохондрий появляется, чтобы вызвать увеличение базовой митохондриальной фрагментации по сравнению с использованием митохондриально локализованного GFP 17. В то время как другие методы, такие как иммунофлюоресценции и электронной микроскопии может быть использован для оценки митохондриальной структуры, они не позволяют оценку в естественных условиях митохондриальных динамики, потому что шаг крепление требуетd. Другие методы, такие как использование митохондрии локализованных красителей можно использовать без фиксации и, следовательно, также могут быть использованы вместо использования митохондриально локализованного GFP. Как обсуждается в следующем разделе, использование таких красителей позволяет сырой оценку в естественных условиях функции митохондрий.
Оценка митохондриальной мембране потенциала в Vivo в С. Элеганс
Разнообразие красителей доступны для маркировки митохондрий 28. Эти красители обеспечивают альтернативный метод визуализации митохондрий структуру сети в живых C. Элеганс. Многие из этих красителей также позволить сырой оценку митохондриальной функциональности в естественных условиях, так как они накапливаются в митохондриях, основанных на митохондриальной мембранного потенциала. Здесь мы использовали C 32 H 32 Cl 2 N 2 O, которая попадает в организм черезпищеварительного тракта, при этом некоторые дополнительно ввод червя через кутикулы из-за проницаемости, предоставляемой растворения в 0,5% ДМСО. После вступления в клетке C 32 H 32 Cl 2 N 2 O окисляется и поглощенных по митохондрии, где он связывается серосодержащих аминокислот (например, метионина и цистеина). Образование этих красителей комплексов пептид-C означает 32 H 32 Cl 2 N 2 O остается в митохондриях раз меченых 28. Основной трудностью при использовании красителей митохондриальных является то, что они будут маркировать все митохондрии в животном. Поэтому мы провели маркировку в CB5600, и того же штамма, описанного выше для оценки мышечной митохондриальной структуры сети. Используя красную митохондриальной краситель, штамм червей, выражающих GFP в мышечной митохондрий, и тройной фильтр, это относительно просто изображение только митохондрии в мышцах, находя митохондрии, которые являются уплотнительныеДиапазон по колокализации красным красителем и GFP меченных митохондрий. Самым сложным этапом в выполнении этой колокализации подход является визуализация потому краситель фото выгоревшие в течение нескольких секунд при высокой интенсивности флуоресцентного света. Этот эффект может быть ограничен, сохраняя флуоресценцию на малой мощности до тех пор, экспериментатор не будет готов к изображению, а затем регулировки интенсивности флуоресценции, соответственно. После того, как один испытывают с использованием красителей и другой подход заключается в использовании конфокальной микроскопии с Z-стеки в образ только митохондрии в правой ткани; митохондриальные сети в мышце совершенно различны по сравнению с другими тканями. К сожалению, неспособность C 32 H 32 Cl 2 N 2 O, чтобы оставить митохондрии 28 означает, что, в отличие от методики саркомера, и митохондриальной изображений обсуждалось выше, он не может быть использован, чтобы перспективно следовать потерю функции митохондрий со временем, если C 32 H 32 Cl 2 N 2 Oдобавляется в дискретные моменты времени, чтобы отделить популяции животных. Это ограничение можно преодолеть, используя красители, такие как JC-10, что делать оставить митохондрии от распада мембранного потенциала 43. Митохондрии также могут быть выделены из С. Элеганс 30 для последующих биохимических анализов. Такая добыча позволяет количественно оценить митохондриальной мембранного потенциала путем количественного определения скорости поглощения липофильных катионный краситель с помощью проточной цитометрии или люминесцентной ридере 44. Установив нарушенную митохондриальный мембранный потенциал, можно также определить, если потеря протонного градиента приводит к потере производства АТФ с помощью чувствительного bioluminometric люциферазы на основе метода 45.
Оценивая белка деградации в С. Элеганс
Штамм червь используется здесь для оценки деградации мышечных белков был PD55, который содержит мышц конкретный βгалактозидазу что постоянно синтезируется в ходе развития до зрелого возраста не будет достигнут и который остается стабильным в цитозоле для следующего 72-96 часов 19. Таким образом, измерение уровня β-галактозидазы в процессе разработки преимущественно указывает на воздействие мероприятий на синтез из миозина промоутера в то время как потеря β-галактозидазы в зрелом возрасте показывает вмешательство вызвало увеличилось деградации цитозольный белка 19. Ключевым шагом в оценке β-галактозидазы является обеспечение эффективного высыхания. Несоблюдение эффективно пересушивает животных приводит к плохому предоставления X-гал субстрата и, следовательно, плохой синего цвета в тело-стеновых мышц животных. Для обеспечения хорошего высыхания печать на эксикаторе должны быть проверены и образец должен быть проверен на 5-10-минутными интервалами на протяжении высыхания для оценки прогресса (т.е. образца 20 мкл следует высохли в пределах 10 минут, а оставшиеся 20 минявляется обеспечение всестороннего высыхания). Β-галактозидазы анализ является анализ активности Поэтому соответствующий контроль имеет важное значение. Кроме того, снизилась окрашивание взрослых в состояние обращение относительно контроля не доказывает, что деградация происходит; а это указывает на снижение ферментативной активности в ответ на лечение. Чтобы подтвердить, деградации, более трудоемкий Вестерн-блоттинга должны быть завершены к β-галактозидазы 13, и это позволяет деградации количественное белка в небольших популяциях, подсчитанных червей. Блот плотности западные группы может быть определена количественно с помощью ImageJ 46. Другим ограничением этого метода является то, что использование трансгенных белков не сообщает, как в физиологических мишеней деградации и для таких ответов протеомические и / или целевые гипотеза приводом Вестерн-блоты должны быть использованы 13. И, наконец, как синтез белка в трансгенных используемого в этих исследованиях выключается в юношеском возрасте 19 </suр>, другие методы должны быть использованы, когда желающих изучить изменения в синтезе белков мышечной в полностью развитой C. Элеганс мышцы; например, стабильные или радиоактивные изотопные методы.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a grant from the US National Institutes of Health National Institute for Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (AR-054342) to NJS. CJG was funded by a Doctoral training studentship funded by the University of Nottingham. JJB was funded by an MRC Doctoral training award (J500495). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
MitoTracker Red CMXRos (C32H32Cl2N2O) | Invitrogen | M-7512 | Red mitochondrial dye which accumulates based on a negative membrane potential |
DMSO | Thermo Scientific | 67-63-5 | |
KH2 PO4 | Sigma | 7778-77-0 | |
Na2HPO4 | BDH | 301584L | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
MgSO4 | Sigma | M-7506 | |
Microscopy Slides | Starfrost | K220 | |
Microscopy Cover Slips | VW2 International | 631-0124 | |
1.5ml Eppendorph Tubes | Fisher Scientific | FB74031 | |
Dessicator | Nalgene | D2672 | |
Nikon Microscope | Nikon | H600L | Nikon H600L microscope with proprietary software |
Nikon Camera | Nikon | DS-Fi1 | Nikon Digital Sight DS-Fi1 digital camera |
Zeiss Microscope | Zeiss | Ax10 | Zeiss AX10 microscope with an Axiocam MRC digital camera and Axiovision LE software and a triple-pass filter |
Plates 9cm | Starstedt | 82-1473 | |
Plates 6cm | Gosselin | BP53-01 | |
Potassium Ferrocyanide | Sigma-Aldrich | 14459-95-1 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
Na3PO4 | Sigma-Aldrich | 7601-54-9 | |
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside | Sigma-Aldrich | 7240-90-6 | |
N,N8-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 68-12-2 | |