Vascular Balloon Skade og intraluminal Administration i Rat Arteria carotis

Summary

Denne protokol anvender et ballonkateter til at forårsage en intraluminal skade på rotte halspulsåren og fremover fremkalde neointimahyperplasi. Dette er en veletableret model til at studere mekanismer vaskulær remodellering i respons på skade. Det er også almindeligt anvendt til at bestemme gyldigheden af ​​potentielle terapeutiske metoder.

Abstract

Halspulsåren ballonbeskadigelse model i rotter er blevet godt etableret i mere end to årtier. Det er fortsat en vigtig metode til at studere de molekylære og cellulære mekanismer involveret i vaskulær glat muskulatur dedifferentiering, neointimadannelse og vaskulær remodellering. Sprague-Dawley-rotter er de hyppigst anvendte dyr til denne model. Hunrotter foretrækkes ikke som kvindelige hormoner er beskyttende mod vaskulære sygdomme og dermed indføre en variation i denne procedure. Den venstre carotis typisk såret med den højre halspulsåre, der tjener som en negativ kontrol. Venstre carotidlæsionen er forårsaget af den oppustede ballon, denudes endothelium og udspile s karvæggen. Efter skade kan potentielle terapeutiske strategier såsom anvendelse af farmakologiske forbindelser og enten genet eller shRNA overførsel evalueres. Typisk for genet eller shRNA overførsel, er skadet del af karhulrummet lokalt transduceret i 30 minutter med viral partikler, der koder for enten et protein eller shRNA til levering og udtryk i den skadede karvæggen. Neointimal fortykkelse repræsenterer proliferative vaskulære glatte muskelceller sædvanligvis topper 2 uger efter skade. Skibe meste høstet på dette tidspunkt for cellulær og molekylær analyse af celle signalveje samt genet og proteinekspression. Fartøjer kan også høstes på tidligere tidspunkter for at bestemme indtræden af ​​ekspression og / eller aktivering af et specifikt protein eller pathway, afhængigt af de eksperimentelle formål bestemt. Fartøjer kan karakteriseres og vurderes ved hjælp af histologiske farvning, immunhistokemi, protein / mRNA assays og aktivitetsassays. Det intakte højre carotidarterie fra samme dyr er en ideel intern kontrol. Skade-inducerede ændringer i molekylære og cellulære parametre kan evalueres ved at sammenligne arterien såret til det indre højre kontrol arterie. Ligeledes kan terapeutiske modaliteter evalueres ved at sammenligne den skaded og behandlet pulsåre til kontrol såret kun arterie.

Introduction

Ballonkatetre er medicinske anordninger, der anvendes i proceduren for angioplastik, med henblik på at udvide obstrueres site (s) af atheroma eller thrombe i et blodkar. Den indsnævrede fartøj lumen er tvunget til at åbne ved den oppustede ballon og blodforsyning vil blive genoprettet sekventielt at lindre downstream iskæmi symptomer, såsom angina pectoris, myokardieinfarkt og smerter i benene. Ikke desto mindre har den store succes med angioplastik blevet formindsket af postoperative komplikationer, såsom resultater fra kraft forårsager vaskulær barotraume (ballon skade), nemlig karvæggen remodellering og i mange tilfælde fornyet forsnævring af lumen fartøj (restenose) ^1.

En række dyremodeller er blevet udviklet efterligne angioplastik procedure for at hjælpe efterforskerne forstå mekanismerne bag ballonen-skade-relaterede karvæg remodeling ^2. Blandt alle de dyrearter, der anvendes til modellering, rotte er den mest anvendte en. Compared til kaniner, hunde og svin, fordelene ved rotter er deres lave omkostninger, deres relative brugervenlighed og den nuværende viden om rotte fysiologi. Selv om mus har en yderligere fordel i en lang række af genetisk manipulerede stammer musene fartøjet er for lille til at indsætte et ballonkateter. I løbet af de seneste tre årtier har forsøgsrotter tilladt forskerne at få bedre forståelse for de molekylære og cellulære mekanismer der ligger til grund neointimadannelse og vaskulær remodellering ^3-6. Beyond ballonbeskadigelse, er vaskulær remodellering også involveret i de fleste større vaskulære sygdomme, såsom aterosklerose ^7,8, hypertension ⁹ og aneurismen ^10. Således opnåede viden gennem ballonen skade modellen er generelt til gavn for de overordnede karvæggen sygdomstilstande studier.

Det overordnede mål med rotte ballonbeskadigelse model er ikke kun til yderligere at forstå vaskulære sygdomme, men også for at teste styrken af ​​nye midler tilsygdomsbekæmpelse ^11,12. Nuværende kliniske lægemiddelbehandling til restenose påføres ved narkotikarelaterede stents placeret via karhulrummet lige efter angioplastik. I dyremodeller, en effektiv endnu mere økonomisk måde til afprøvning af nye middel er et veludviklet lokalt intraluminal perfusion metode. Kandidatmidler der er blevet testet gennem denne metode omfatter småmolekylelægemidler ^13,14, cytokin eller vækstfaktorer ^15,16, gen manipulere midler (cDNA kloner, siRNA, etc.) ^17-20, og nye farmaceutiske formuleringer ^21,22.

Hidtil rotten ballonbeskadigelse model er stadig en af ​​de mest nyttige modeller til at studere vaskulære sygdomme / lidelser. Det er det grundlæggende skridt fra bench to bedside, som regel som det første skridt bevæger sig fra in vitro til in vivo, men det bør ikke være den sidste. Resultatet af rotteforsøg skal droeftes og yderligere kendetegnet inden oversættelse i humanklinisk brug på grund af forskellen i vaskulære senge og fartøj anatomi samt de iboende artsforskelle mellem human og rotte ^23-26. Det er dog stadig et vigtigt redskab i translationel medicinsk forskning. Mens denne forskning bruges til at være begrænset af mangel på genetisk modificerede rotter, har det ikke længere været et problem siden nye genomiske metoder såsom zink-finger nukleaser ^27, Talens ²⁸ og CRISPR-Cas ²⁹ har gjort knockout rotter let tilgængelige.

Protocol

BEMÆRK: Brugen af ​​dyr til de følgende forsøg er blevet gennemgået og godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC). 1. Præoperative Procedurer Steriliser kirurgiske instrumenter før brug. Autoklaver alle kirurgiske instrumenter 24 timer eller mindre før operation. Hvis flere operationer udføres på samme dag, sterilisere instrumenterne med en tør perle sterilisator i mellem operationer. Filter-sterilisere saltvandsop…

Representative Results

To uger efter skaden er halspulsårer høstes, sektioneret og underkastet morfologisk analyse. Arterier tværsnit og farvet med H & E (figur 1, 2B, C og 3). Rat carotidarterie væg indeholder fire lag af elastisk lamina, som vises som lyserøde linjer. Området mellem den yderste lamina ekstern elastisk lamina (EEL), og den inderste lamina, intern elastisk lamina (IEL) er medierne glat muskel lag (Figur 1). Området inde i IEL er intima, et monolag af endotelceller i intakte fartøj…

Discussion

Rotten carotis ballon skade er blevet godt beskrevet af Tulis i 2007 ^34. Det er blevet omfattende diskuteret alle detaljerne i denne procedure af Dr. Tulis. De læsere, der er interesserede i at udføre denne procedure er stærkt anbefales at læse Tulis 'protokol. Men der er én ting, vi ikke enige med Dr. Tulis: I stedet for at puste ballonen med saltvand eller nogen form for væske, vi foreslog at puste det med luft. Ifølge vores personlige erfaringer, kan puste med væske næppe undgå luftbobler. Desuden er det sværere…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Fogarty balloon embolectomy catheters, 2 French	Edwards Lifesciences, Germany	120602F
Deltaphase Operating Board – Includes 2 Pads & 2 Insulators	Braintree Scientific, Inc.	39OP
LED light source	Fisher Scientific	12-563-501
Hartmann Mosquito Forceps 4” curved	Apiary Medical, Inc. San Diego, CA	gS 22.1670
Crile Retractor 4” double ended	Apiary Medical, Inc.	gS 34.1934
Other surgical instruments	Roboz Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg, MD
Peripheral Intravenous (I.V.) Cannula, 24G	BD	381312
Ketamine HCl, 100mg/mL, 10mL	Ketaset- Patterson Vet	07-803-6637
Xylazine (AnaSed),20mg/mL,20mL	Ketaset- Patterson Vet	07-808-1947
Buprenex, 0.3mg/1ml (5 Ampules/Box)	Ketaset- Patterson Vet	07-850-2280
Nair Baby Oil Hair Removal Lotion-9 oz	Amazon/Walmart/CVS	N/A
Inflation Device	Demax Medical	DID30
D300 3-way Stopcock	B.Braun Medical Inc.	4599543
Artificial Tears Ointment	Rugby Laboratories, Duluth, GA	N/A