ヒト骨格筋からの一次筋原細胞および線維芽細胞の単離および定量的免疫組織化学的特性評価
Summary
The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.
Abstract
骨格筋の修復および再生は、常駐筋肉幹細胞である、衛星細胞の作用を必要とする。これらは、酵素消化を用いてヒト筋肉生検試料から単離することができ、それらの筋原性性質は、培養で研究。定量的には、酵素消化から得られた二つの主要な接着細胞型がある：CD56 +として最初に同定された（i）の衛星細胞は、（筋原細胞又は筋前駆細胞とも呼ばれる）、およびそれ以降のCD56 + /デスミン+細胞など、および（ii）muscle-とTE-7 + – CD56として識別由来の線維芽細胞、。線維芽細胞は培養液中で非常に効率的に増殖し、混合細胞集団においてこれらの細胞は、培養を支配する筋原細胞をオーバーランすることができる。培養中の細胞型のいずれかの生来の挙動を調査しようとしたときに、人間の筋肉とは異なる細胞型の単離および精製は、このように重要な方法論的な考慮事項である。ここでは、非難される両方の高純度（> 95％筋原細胞）および良好な収率（〜を与えるコラゲナーゼを用いて細胞の穏やかな酵素消化に基づいて並べ替えや磁気活性化細胞選別（MACS）が続くディスパーゼのシステムをIBE 2.8×10 6±8.87培養での実験のためのin vitroでの 7日後に×10 5細胞/ g組織）。このアプローチは、CD56に対する抗体にコンジュゲートした磁気ビーズのビーズと混合筋肉由来細胞集団をインキュベートした後、磁場も細胞を通過させるに基づいている。細胞カラムを通過妨げられずに通過する– CD56が、一方、マイクロビーズに結合されたCD56 +細胞は、フィールドによって保持されている。選別プロセスの任意の段階からの細胞懸濁液を播種し、培養することができる。所与の介入、細胞の形態以下、核転写因子を含むタンパク質の発現および局在を免疫特異的な抗体で標識し、画像のpを用いて定量することができるrocessingと解析パッケージ。
Introduction
骨格筋の修復および再生は2,3筋原幹細胞、衛星細胞1の作用を必要とする。 インビボでこれらの細胞はあらゆるmyofibreの筋細胞膜と基底膜の間に位置して可逆的に静止状態で存在するが、増殖するように活性化され、ヒューズ及び筋肉組織として分化するが、損傷を受けた修理および3を再生する。衛星細胞は、酵素消化4を用いて、若年および高齢のヒト筋肉生検試料から単離することができ、それらの筋形成特性は、その後、初代培養5に研究することができる。細胞集団の両方の収率および純度に関して、この分離プロセスの効率は、使用される方法に依存し、サンプル間で変化し得る。酵素消化から得られた二つの主要な接着細胞型は、CD56 + /デスミン細胞、およびμとして最初に同定された衛 星細胞（現在称される筋原細胞又は筋前駆細胞）、あるCD56として識別SCLE由来線維芽細胞、 –とTE7 +細胞5。線維芽細胞は、急速な増殖率を持っており、筋原細胞のような細胞間接触の際に不可逆的な増殖停止および最終分化を受けない。したがって、混合集団に、線維芽細胞は、文化を支配する筋原細胞をオーバーランすることができる。
線維芽細胞は、多くの場合、しかし、それ自体で研究の価値がある細胞のような線維芽細胞への関心の高まりは、それらが筋肉修復6時の筋原細胞との協力的な役割を持っていることが示されている、特にとして、今そこにある、筋肉の生物学者のための刺激として見てきた。ヒト筋肉異なる細胞型の単離および精製は、このように、培養中の両方の細胞型の先天性挙動を調査しようとしている方法論の重要な考慮事項である。蛍光活性化細胞選別（FACS）は、細胞は、さらなる研究のために選別することができる方法、および/または、計数し分析した。 FACSは、確実に、ヒト筋原細胞を濃縮することが示されているが、その後の培養のための細胞の収率は、これまで7高くはなかった。そのような老化4に関連した衛星細胞由来の筋原細胞と非常に貧しい増殖や分化などの体細胞の限定された複製の可能性を考えると、より穏やかなアプローチが必要とされる。シングル筋線維培養は別のは、あまり積極的で、彼らのsublaminalニッチと文化8,9におけるそれらの活性化の後にまだ常駐マウス衛星細胞を得る手段を提供。しかし、これは、この技術がヒト筋肉由来細胞を研究することに興味の多くの研究室にアクセス可能でないかもしれないことを意味する（繊維はめったに腱の腱から得ることができないため）、ヒト筋生検材料からしばしば不可能である。また、単繊維の技術は非常に限られた細胞数を提供する。
ここでは、GENに基づいて並べ替えのシステムを説明TLEの酵素コラゲナーゼを用いて細胞の消化と高純度（> 95％筋原細胞）および収率（〜2.8×10 6±8.87×10 5細胞/両方を与えソーティング（MACS）、磁気活性化細胞の2連続ラウンドが続くディスパーゼ培養での実験のためのg組織）。 CD56は、in situ 10 およびインビトロ 11 におけるヒト衛星細胞の同定のためのゴールドスタンダード表面マーカーとみなされ、ビーズ結合のための理想的な表面マーカー候補を提供している。このアプローチのCD56に酸化鉄および多糖を含む超常磁性ビーズに結合した抗体を細胞に結合され、強磁場12,13に配置された高勾配磁気細胞分離カラムに通した。分離カラムは、強い磁場勾配を生成するそれらの表面に向かって磁力線を集中させる役割を果たす強磁性スチールウールや鉄球の行列（〜4tesla）14が充填されている。これらの列では、少しでも磁気細胞は、その表面14に引きつけられ吸着される。結合していない（CD56 – ）は、磁気マイクロビーズで標識されたCD56 +細胞は、磁界12,15から除去されるまで保持されているのに対し、細胞がカラムを通過する。
選別プロセスの任意の段階からの細胞懸濁液は、さらなる実験のために所望の密度で播種することができる。細胞成分は免疫細胞化学を用いて同定することができる特定の介入後、広視野または共焦点蛍光顕微鏡を用いて画像化し、任意の画像内のすべての標識細胞の急速な客観的測定を可能にする画像解析手法を用いて定量的に分析した。筋原細胞一方で、ヒト線維芽細胞は容易に脂肪細胞への分化転換–私たちの研究室では、そのCD56を実証するために、画像解析16に続いて、この二重の免疫磁気ソーティングアプローチを使用していた衛星由来のsがこの脂肪生成変換5に対して非常に耐性がある。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々は、筋生検材料の少量の試料からのヒト筋肉由来前駆体の選択的濃縮のためimmunomagentic選別手順を記載している。この手法は、線維芽細胞にヒト筋肉由来の文化の損失を克服するための、だけでなく、筋肉由来前駆細胞の異なる集団のユニークな振る舞いを理解するための私たちの研究室では非常に貴重なてきた。精製した後筋原細胞は、タンパク質および/または遺伝子発現の変化を調?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors wish to thank Carl Hobbs and Lindsey Majoram for their technical assistance, and Professor Pat Doherty for use of microscopy facilities. Dr. Agley was supported by a studentship from King’s College London. Funding from the Spurrell Trust is also acknowledged.
Materials
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | Must be filter sterilized before use |
| Trypsin/EDTA | (Gibco) Invitrogen | 15400-054 | |
| 100 micron cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| Collagen solution ( 3 mg/ml in 0.1% acetic acid) | Sigma, Dorset, UK | C8919 | |
| Minisart SRP15 syringe filter (0.2 micron) | Sartorius | 17573ACK | Polytetrafluorethylene (PTFE) membrane |
| CD56 human Microbeads | Miltenyi Biotech | 130-050-401 | Be aware of the limited shelf life of microbeads |
| Anti- fibroblast Microbeads, human | Miltenyi Biotech | 130-050-601 | |
| 40 μm Pre-separation filters | Miltenyi Biotech | 130-041-407 | |
| Large Cell Collumns | Miltenyi Biotech | 130-042-202 | These columns come with a flow resistor. Use of the flow resistor is not necessary to obtain the high myogenic purities described here. |
| LS columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MiniMacs Seperator | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | This separator fits the large cell column but not the LS column. |
| MidiMACS | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| BSA | Sigma | Must be filter sterilized before use | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| Triethyl phosphate | Sigma | 538728 | |
| Whatman Paper | Sigma | Z241121-1PAK | No. 42, Ashless. To prepare the filter fold the circular filter paper to make a semi circle, then fold the semi-circle in half again to form a cone shape. Fit the cone into a funnel for filtering. |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Molecular Probes, Invitrogen | P36930 | This can be purchased with or without DAPI and does not quench initial fluorescence. |
| AxioVision | Carl Zeiss | Contact Zeiss | |
| Adobe Photoshop CS5 Extended | Adobe (purchased from Pugh Computers) | ADPH16982* |
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