Hızlı Floresan<em> In Situ</emX-kromozomu İnaktivasyonu içinde histon Modifikasyon İmmünofloresan ile Xist RNA Kombine için> Hibridizasyon Protokolü
Summary
We developed an easily customized strand-specific fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol combined with immunofluorescence. This allows for a detailed examination of RNA dynamics with simultaneous insight into the chromatin structure, nuclear organization, and transcriptional regulation at the single cell level.
Abstract
Immünfloresans (immün-FISH) ile in situ hibridizasyon (FISH) RNA floresan proteinleri birleştiren, epigenetik değişiklikler ve diğer detaylar lokalizasyonu içine eşzamanlı bir bakış açısı ile RNA lokalizasyonu mekansal dinamiklerini tespit etmek için tek hücre düzeyinde istihdam edilebilir bir teknik oluşturur hangi immünofloresan vurgulanmış olabilir. X-kromozomu inaktivasyonu uzun olmayan kodlama RNA (lncRNA) aracılı gen susturulması için bir paradigma olduğunu. Memeli kadınlarda iki X-kromozom birinde (bir Xist bulut denir) X-inaktif özel transkript (Xist) lncRNA birikimi X-kromozomu inaktivasyonu başlatmak için kritik bir adımdır. Xist RNA doğrudan veya dolaylı olarak çeşitli kromatin-modifiye enzimler ile etkileşim ve inaktif X-kromozomu (Xi) için ayrı epigenetik manzara tanıttı. Xi biri bilinen epigenetik damgasını Histone H3 trimetil-lizin 27 (H3K27me3) değişiklik. Burada, biz basit ve hızlı bir immün FISH tarifXist RNA lokalizasyonu ve ilişkili epigenetik değişiklikleri incelemek için H3K27me3 immünofloransı ile birleştiğinde birden oligonükleotid probları ile RNA FISH kullanarak Xist RNA tespiti için protokol. Oligonükleotid probları daha kısa bir kuluçkalama süresi sonuçları in vitro ötelenmiş RNA probları (riboprobları) göre Xist RNA daha hassas algılama kullanılması. Bu protokol lncRNAs dinamiklerini ve ilgili epigenetik değişiklik, kromatin yapısı, nükleer organizasyon ve transkripsiyon düzenleme anlamak için güçlü bir araç sağlar.
Introduction
Memeli X-kromozomu inaktivasyonu (XCI) kadınlarda iki X-kromozomu biri transkripsiyonel 1 inaktive burada XX ve XY arasındaki X-bağlantılı gen doz dengesizliği telafi etmek için bir stratejidir. X-kromozomu inaktivasyonu uzun olmayan kodlama RNA (lncRNA) araştırma için harika bir model sistemidir. X-kromozomu inaktivasyonu birden lncRNAs tarafından düzenlenir ve yoğun lncRNAs, transkripsiyon, kromatin yapısı ve nükleer organizasyonu 2, 3 arasındaki karışma mekanizmaları ortaya çıkarmak için son birkaç yılda çalışılmıştır.
X kromozomunda bulunan X inaktivasyon merkezi (XIC) kodlayıcı olmayan RNA'lar 4 üreten genlerin bir dizi içeren bir kompleks genetik lokus olduğu. X-aktif spesifik transkript (Xist) lncRNA eutherian memelilerde X kromozomu inaktivasyonu 5,6 çok önemli bir rol oynar böyle bir lncRNA olup. Xist transkript fu yerini çevreleyenTure Xi X-kromozomu inaktivasyonu başlatmak ve RNA FISH kullanılarak görüntülendi zaman bir bulut gibi görünmesini; Bu oluşum "Xist Cloud" 7 olarak adlandırılır. Xist RNA, çeşitli kromatin değiştirici enzimler ile etkileşim için, sessiz bir kromatin ve baskı transkripsiyon için farklı epigenetik değişiklikler ile Xist bulutlar eş-lokalizasyonu X kromozomu inaktivasyonu 8 süresince gözlenir. Örneğin, Xist RNA H3K27me3 sorumludur ve baskıcı bir kromatin devlet 9 uyaran Polycomb baskıcı kompleksi 2 (PRC2) ile etkileşime girer. Xi ve yoğun H3K27me3 modifikasyonu ile birlikte yerelleştirme Xist bulut oluşumu Xi 10,11 bir fakültatif heterokromatinin manzara temsil eder.
Böyle DNA / RNA FISH gibi sitogenetik teknikler, gelişmiş hassasiyet ile son ve gelişmiş teknikler, radyoaktif işaretli problar 12 kullanılarak geleneksel yöntemle uzun bir yol katettikBirden fazla oligonükleotid sondaları 13,14 kullanılarak flüoresan görüntüleme. Immünofloresan ile birleştiğinde DNA / RNA BALIK rutin Spatiotemporal nükleer organizasyonu, RNA lokalizasyonu, kromatin yapısını ve değişiklikleri anlamak için bir sitolojik araç olarak kullanılmıştır. RNA, FISH için pek çok standart prob hazırlama plazmid ya da bakteriyel yapay kromozom (BAC) klonu ve çentik translasyonu veya rastgele prime 15 ya da daha sonraki etiketi kullanılmasını içerir. Bununla birlikte, farelerde genlerin yaklaşık% 70 ve insanlarda genlerin% 40 sens ve antisens transkriptleri ayırmak için bu nedenle bir büküm özel FISH yöntem gerektiren, sens ve antisens transkriptleri 16 bir üst üste göstermektedir. İn vitro transkribe RNA sondaları (riboprob ) genellikle iplik-spesifik RNA FISH 17,18 için kullanılır; bununla birlikte, bu, T7, SP6 veya T3 promoteri ve sentezlenmesi riboprobes bir plazmid klonu ya da PCR ürün hazırlama içerir. Ayrıca, genomunun elde riboproblarıic DNA veya cDNA sık sık yüksek arka plan gürültüsü neden non-spesifik bölgeleri ve tekrarlayan unsurlar içerir. Diğer konu da, uzunluğu bir kaç yüz nükleotidlerdir ve birden florofor içeren riboprobları, etkili bir çekirdek içine girmek edemezler. Bu aşmak için, ucunda tek bir florofor ile işaretlenmiş çok sayıda daha kısa oligonükleotid probları iyi hassasiyet, düzgün sinyal kuvveti ve saflaştırma kolaylığı ve 14 taşıma olduğu geliştirilmiştir. Buna ek olarak, DNA oligonükleotidleri, genel olarak RNA daha stabildir. Bu X kromozomu etkisizleştirme işlemi sırasında Xist lncRNA neden Xi epigenetik dinamiklerini anlamak için immünofloresan ile Xist RNA, FISH 19 oligonükleotidleri kullanılarak benzer bir strateji uygulanır. Bu protokol, oligonükleotid prob ve hücrelerin uygun hazırlama oluşturma, hem de bağışıklık ve RNA FISH kullanımını tarif etmektedir. Birden oligonucle kullanarak Xist RNA BALIKXist RNA BALIK kişinin laboratuvarında rutin olarak ise, SEK, uzun vadede maliyet etkin bir yaklaşımdır. Bu teknik aynı zamanda epigenetik değişiklikler ya da faktörleri ile birlikte-lokalizasyonunu haritalama ise hücrelerinde lncRNAs tanımlamak için kullanılabilir. Protokolün bir büyük avantajı kolayca kişinin araştırma çıkarlarına uygun şekilde değiştirmek için yeteneğidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda, H3K27me3 için slayt hazırlama, Xist RNA FISH ve immünoflüoresans tamamlamak için en az 5 saat sürer hızlı bir bağışıklık BALIK protokolü sundu. Genellikle RNA FISH gecede inkübasyon ihtiyacı Xist RNA saptanması, genel bağışıklık FISH yaklaşımı ile karşılaştırıldığında, bu protokol önemli ölçüde harcanan zamanı azaltır, aynı zamanda oligonükleotid probları kullanılarak bağışıklık FISH duyarlılığını artırır sadece.
Xist yüksek…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Hongjae Sunwoo for helpful advice for oligonucleotide design in RNA FISH. We also thank Serenity Curtis for editing the manuscript. N.Y. was supported by a Postdoctoral Fellowship for Research Abroad of the Japan Society for the Promotion of Science (JSPS). This work was supported by the NIH (RO1-GM102184), the March of Dimes Research Foundation (#6-FY12-337), and the Developmental Fund and Trustee Grant at Cincinnati Children’s Hospital Medical Center to Y.O.
Materials
| oligonucleotides with 5’-amine modification | IDT | |
| Alexa Fluor 488 Reactive Dye | Life Technologies | A32750 |
| MicroSpin G-25 columns | GE Healthcare | 27-5325-01 |
| Cytospin 2 | Shandon | 59900102 |
| Bovine Serum Albumin, Molecular Biology Grade (for hybridization buffer) | Roche | 10715859103 |
| Histone H3K27me3 antibody | Active Motif | 61017 |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse, highly cross-adsorbed | Life Technologies | A21424 |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36931 |
Referências
- Payer, B., Lee, J. T. X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance. Annu Rev Genet. 42, 733-772 (2008).
- Lee, J. T. Gracefully ageing at 50, X-chromosome inactivation becomes a paradigm for RNA and chromatin control. Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 815-826 (2011).
- Gendrel, A. V., Heard, E. Fifty years of X-inactivation research. Development. 138, 5049-5055 (2011).
- Froberg, J. E., Yang, L., Lee, J. T. Guided by RNAs: X-inactivation as a model for lncRNA function. J Mol Biol. 425, 3698-3706 (2013).
- Penny, G. D., Kay, G. F., Sheardown, S. A., Rastan, S., Brockdorff, N. Requirement for Xist in X chromosome inactivation. Nature. 379, 131-137 (1996).
- Marahrens, Y., Panning, B., Dausman, J., Strauss, W., Jaenisch, R. Xist-deficient mice are defective in dosage compensation but not spermatogenesis. Genes Dev. 11, 156-166 (1997).
- Clemson, C. M., McNeil, J. A., Willard, H. F., Lawrence, J. B. XIST RNA paints the inactive X chromosome at interphase: evidence for a novel RNA involved in nuclear/chromosome structure. J Cell Biol. 132, 259-275 (1996).
- Sado, T., Brockdorff, N. Advances in understanding chromosome silencing by the long non-coding RNA. Xist. Phil Trans R Soc B. 368, 20110325-20 (2013).
- Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome. Science. 322, 750-756 (2008).
- Plath, K., et al. Role of histone H3 lysine 27 methylation in X inactivation. Science. 300, 131-135 (2003).
- Silva, J., et al. Establishment of histone h3 methylation on the inactive X chromosome requires transient recruitment of Eed-Enx1 polycomb group complexes. Dev Cell. 4, 481-495 (2003).
- Gall, J. G. Differential synthesis of the genes for ribosomal RNA during amphibian oogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 60, 553-560 (1968).
- Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat Methods. 5, 877-879 (2008).
- Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol Biol. 463, 297-308 (2008).
- Katayama, S., et al. Antisense transcription in the mammalian transcriptome. Science. 309, 1564-1566 (2005).
- Ogawa, Y., Xite Lee, J. T. X-inactivation intergenic transcription elements that regulate the probability of choice. Mol Cell. 11, 731-743 (2003).
- Panning, B. X inactivation in mouse ES cells: histone modifications and FISH. Methods Enzymol. 376, 419-428 (2004).
- Khalil, A. M., et al. Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11667-11672 (2009).
- Martin, G. R., Evans, M. J. Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 1441-1445 (1975).
- Lee, J. T., Lu, N. Targeted mutagenesis of Tsix leads to nonrandom X inactivation. Cell. 99, 47-57 (1999).
- Zhang, L. F., et al. Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells. Genética. 182, 685-698 (2009).
- Raj, A., Tyagi, S. Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes. Methods Enzymol. 472, 365-386 (2010).
- Kimura, H., Hayashi-Takanaka, Y., Goto, Y., Takizawa, N., Nozaki, N. The organization of histone H3 modifications as revealed by a panel of specific monoclonal antibodies. Cell Struct Funct. 33, 61-73 (2008).
- Ogawa, Y., Sun, B. K., Lee, J. T. Intersection of the RNA interference and X-inactivation pathways. Science. 320, 1336-1341 (2008).
- Kohlmaier, A., et al. A chromosomal memory triggered by Xist regulates histone methylation in X inactivation. PLoS Biol. 2, 171 (2004).
- Wang, K. C., Chang, H. Y. Molecular mechanisms of long noncoding RNAs. Mol Cell. 43, 904-914 (2011).
