マイカの製造は、高分解能光学顕微鏡イメージングのための脂質二重層をサポート
Summary
我々は、高解像度の顕微鏡検査のために雲母支持された脂質二重層を調製する方法を提供する。マイカは、原子スケールで透明で平坦であるが、まれに、取り扱いの困難の撮影で使用されていません。我々の調製マイカシートの偶数堆積をもたらし、二層の調製に使用される材料を減少させる。
Abstract
サポートされている脂質二重層（のSLB）が広く膜特性（相分離、クラスタリング、ダイナミクス）およびこのような薬物またはペプチドなどの他の化合物との相互作用を研究するためのモデルとして使用される。しかしSLB特性は使用される支持によって異なります。
SLB画像化および測定のための一般的に使用される技術は、単一分子蛍光顕微鏡法、FCSおよび原子間力顕微鏡（AFM）である。 AFMは極めて平坦面（一般に雲母）を必要とするほとんどの光イメージング研究は、ガラス支持体上で実施されるため、これらの材料の電荷と平滑特性が強く拡散に影響を与えるので、これらの技術からの結果は、直接比較することはできない。残念ながら、スライドガラスに切断し、雲母の薄いスライスを接着するために必要な手先の器用さの高レベルは、SLBの準備のためのマイカの日常的な使用にハードルを提示します。これは選択の方法、そのような準備マイカになりますが表面は、多くの場合、特に小さなワーキングディスタンス、高開口数レンズを、凹凸（波線）と画像が困難になってしまう。ここでは、脂質小胞沈着およびSLBの準備のために、薄く平らな雲母表面を調製するためのシンプルかつ再現可能な方法を提示する。さらに、当社のカスタムメイドのチャンバーは、SLBの形成のための小胞の非常に小さなボリュームを必要とします。 AFM研究において使用されるものと直接比較され、高品質の脂質二重層表面の、効率的な簡単で安価な製造の全体的な手順をもたらす。
Introduction
本プロトコルの全体的な目標は、また原子間力と組み合わせることができる光全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）または共焦点顕微鏡を用いて雲母支持された脂質二重層（のSLB）の高分解能イメージングのために雲母表面を調製する方法を示すことである顕微鏡（AFM）。
のSLBは、脂質クラスタリング、相分離、ペプチド、タンパク質または他の化合物1-5との二重層成分またはそれらの相互作用の動力学の多くの研究のために広く使用されるモデルである。異なる基質は、研究4,6-8の性質に応じてSLB形成（ すなわち 、ガラス、雲母、二酸化ケイ素、ポリマー）のために使用され得る。典型的な膜の研究では、このようなTIRFMおよびAFMなどの顕微鏡ベースのイメージング技術に依存している。ガラスは透明であるので、従って、TIRFMイメージングのために、ガラス表面は、典型的な選択である。ガラスの製造は比較的容易であり、結果の質は、主に前脂質小胞の沈着に清掃の徹底面で決定。その高距離分解能によるAFMは、雲母表面を必要とします。マイカは完璧な基礎の切断に近いと、ケイ酸塩鉱物である。これにより、新たに切断された雲母が偶数サブナノメートルスケールで膜9の高さの差の観察を可能にする、原子的に平坦である。
（FRAP）の光退色後の、蛍光相関分光法（FCS）、（SMT）を追跡する単一分子、および蛍光回復などの方法を用いて拡散研究は、それによって、ガラス、脂質膜のダイナミクスは、それらが堆積される表面の種類に大きく依存することが示されたマイカは、広くさまざまな結果を10,11を与えることができます。これらの違いは、膜プローブの拡散係数でなく、異なる速度で拡散粒子の別個の集団の検出、およびおそらく異なる状態間の切り替えのみならず挙げられる。
このように、同じ表面（この場合マイカで）使用されない限り、TIRFMおよびAFM技術を用いて得られた結果の直接比較は、しばしば問題となる。 TIRFMおよびAFM二層イメージングは同じ雲母表面12,13上で実施されたいくつかの研究がありますが、マイカはほとんど主な原因の取り扱いの問題により、光学顕微鏡のために使用されていません。マイカの準備をして、光学接着剤12を使用してカバースリップに接着された薄いリーフレットの中に手で切断する必要があります。しかしながら、この方法は満足な結果を達成するために、いくつかの練習を必要とする。また、得られた表面は、それらが困難な低ワーキングディスタンス、高開口数レンズを使用すること、およびしばしば波状の厚さである。
このプロトコルに記載のように調製した雲母表面が成功した高分解能イメージングのため重要となる、「うねり」を避け、非常に薄い（〜220ミクロン、170ミクロンのカバーガラスの厚さを含む）と、非常に平坦である。それらを使用することができるTIRFMまたは共焦点セットアップ用。さらに、同じサンプルを、AFMに転送することができ、さらにはTIRFM /共焦点及びAFMと同時に画像化した。これら2つの手法を組み合わせることにより、二分子膜構造14との拡散挙動の直接的な相関関係が可能になります。雲母表面が新たに切断されるので、清潔で、（ガラス洗浄プロトコルは、通常、ピラニア溶液、硫酸ナトリウム/水酸化カリウムなどの化学物質を含む）時間がかかり、再現性に乏しい、潜在的に危険な清掃手順を必要としない。また、プロトコルに記載小室、の装着未満、50μlに効果的な二重層形成に必要な小胞の体積を減少させる。最後に、表面アセンブリの全体のプロセスは時間がかかるでない（調製物は、30分未満を要する）、および従来の、雲母切断および接着が行うように、操作の熟練度が高い必要としない。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、脂質二重層の沈着及び高分解能イメージングのための滑らかで薄い雲母表面を調製するための方法が記載されている。技術は、主に高品質の雲母表面を得るために重要であるガラスマイカ – ガラスのサンドイッチ（ステップ2.8）、慎重に解体に限定最小限の手動スキルを必要とします。マイカは、切断せずに光学接着剤から剥離することが可能であるので、新たに切断さ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は全く確認応答がありません。
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Bath Sonicator | Fisher Scientific | FB15051 | |
| Coverslips 24 x 50mm – No H1.5 | Marienfeld | 102222 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850357 | |
| Hellmanex III (detergent) | Hellma Analytics | 320.003 | |
| Mica V-1 Grade | SPI Suppliers | 1872-CA | |
| Optical Adhesive (high viscosity) | Norland Products | NOA63 | |
| Optical Adhesive (low viscosity) | Norland Products | NOA60 | |
| Sphingomyelin-ATTO647N | AttoTec | AD 647N-171 | |
| UV lamp | Synoptics Ltd. | GelVue GVM20 | The lamp was set to 100% power |
Referências
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