Preparazione di Mica supportati doppi strati lipidici per alta risoluzione microscopia ottica Imaging
Summary
Vi presentiamo un metodo di preparazione mica supportato doppi strati lipidici per microscopia ad alta risoluzione. Mica è trasparente e piatto su scala atomica, ma raramente usata nell'imaging a causa della difficoltà di manipolazione; nostra preparazione comporta anche deposizione del foglio di mica, e riduce il materiale utilizzato nella preparazione bistrato.
Abstract
Doppi strati lipidici supportati (SLB) sono ampiamente usati come modello per lo studio delle proprietà di membrana (separazione di fase, di clustering, dinamica) e la sua interazione con altri composti, come i farmaci o peptidi. Tuttavia caratteristiche SLB variano a seconda del supporto utilizzato.
Tecniche utilizzate comunemente per SLB l'imaging e le misure sono single microscopia a fluorescenza molecola, FCS e microscopia a forza atomica (AFM). Poiché la maggior parte degli studi di imaging ottico sono effettuate su un supporto di vetro, mentre AFM richiede una superficie estremamente piatta (generalmente mica), i risultati di queste tecniche non sono direttamente confrontabili, in quanto le proprietà di carica e di funzionamento di questi materiali influenzano fortemente diffusione. Purtroppo, l'alto livello di destrezza manuale richiesto per il taglio e incollaggio fette sottili di mica al vetrino presenta un ostacolo di utilizzare sistematicamente mica per la preparazione SLB. Sebbene questo sarebbe il metodo di scelta, come mica preparatosuperfici spesso finiscono per essere irregolare (ondulato) e difficile da immagine, soprattutto con la piccola distanza di lavoro, alti lenti apertura numerica. Qui vi presentiamo un metodo semplice e riproducibile per la preparazione di sottili superfici piane mica per la deposizione lipidica delle vescicole e preparazione SLB. Inoltre, la nostra camera di misura richiede solo piccole quantità di vescicole per la formazione SLB. I risultati procedura generale nella produzione efficiente, semplice ed economico di superfici doppio strato lipidico alta qualità che sono direttamente paragonabili a quelli utilizzati negli studi AFM.
Introduction
L'obiettivo generale del presente protocollo è quello di mostrare un metodo per preparare le superfici mica per imaging ad alta risoluzione di mica sostenuta lipidi bistrati (SLB) utilizzando la microscopia ottica riflessione interna totale in fluorescenza (TIRFM) o la microscopia confocale, che potrebbe anche essere combinato con forza atomica Microscopy (AFM).
SLB sono un modello ampiamente utilizzato per numerosi studi di raggruppamento lipidi, separazione di fase, la dinamica di componenti a doppio strato o loro interazioni con peptidi, proteine o altri composti 1-5. Substrati differenti potrebbero essere utilizzati per la formazione SLB (cioè vetro, mica, biossido di silicio, polimeri) a seconda della natura dello studio 4,6-8. Gli studi di membrana tipiche si basano su tecniche di imaging basata microscopia-, come TIRFM e AFM. Così, per l'imaging TIRFM, una superficie di vetro è una tipica scelta perché il vetro è trasparente. Preparazione del vetro è relativamente facile, e la qualità dei risultati è principalmentedeterminato dalla accurata pulizia prima della deposizione delle vescicole lipidiche superficie. AFM grazie alla sua elevata risoluzione assiale richiede superfici di mica. Mica è un minerale silicato, con quasi perfetta scissione basale. Così, la mica appena spaccati è atomicamente piatta, che permette l'osservazione di membrana dislivelli anche a scala sub-nanometrica 9.
Studi di diffusione con metodi quali la spettroscopia di correlazione di fluorescenza (FCS), singola molecola di inseguimento (SMT), e recupero di fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) hanno mostrato tuttavia che la dinamica della membrana lipidica dipende fortemente dal tipo di superficie su cui sono depositati, per cui vetro e mica può dare risultati ampiamente variabili 10,11. Queste differenze sono non solo i coefficienti di diffusione delle sonde di membrana, ma anche l'individuazione di popolazioni separate di particelle diffondenti con tassi differenti, e possibilmente la commutazione tra i diversi stati.
Così,il confronto diretto dei risultati ottenuti utilizzando tecniche TIRFM e AFM è spesso problematico, a meno che la stessa superficie (in questo caso mica) viene utilizzato. Anche se ci sono alcuni studi in cui TIRFM e imaging AFM doppio strato è stata condotta sulla stessa superficie mica 12,13, mica è usato raramente per la microscopia ottica, soprattutto a causa di problemi di gestione. Preparazione Mica richiede il taglio a mano in foglioline sottili, che sono incollati ad coprioggetto con adesivo ottico 12. Questo metodo richiede tuttavia una certa pratica per ottenere risultati soddisfacenti. Inoltre, le superfici ottenute sono spesso ondulati e di spessore, che li rende difficili da utilizzare con bassa distanza di lavoro, alti lenti apertura numerica.
Mica superfici preparate come descritto in questo protocollo sono molto sottili (~ 220 micron, compreso lo spessore vetrino di 170 micron) ed estremamente piatta, evitando di "ondulazione", che è fondamentale per il successo di imaging ad alta risoluzione. Possono essere utilizzatiper TIRFM o confocale configurazioni. Inoltre, gli stessi campioni possono essere trasferiti AFM, e anche ripreso contemporaneamente TIRFM / confocale e AFM. La combinazione di queste due tecniche consente di correlazione diretta del comportamento diffusione con struttura a membrana a doppio strato 14. Poiché le superfici mica sono appena spaccati, sono pulite e non richiedono molto tempo, scarsamente riproducibile, e le procedure di pulizia potenzialmente pericolosi (protocolli di pulizia di vetro di solito includono sostanze chimiche come soluzione Piranha, acido solforico, idrossido di sodio / potassio). Montaggio di una piccola camera, anche descritto nel protocollo, riduce il volume di vescicole necessari per la formazione bistrato efficace e meno di 50 microlitri. Infine, l'intero processo di assemblaggio superficie non è molto tempo (preparazione richiede meno di 30 minuti), e non richiede un elevato grado di abilità manuale, così come convenzionale scissione mica e incollaggio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive un metodo per preparare superfici mica lisce e sottili per deposizione bistrato lipidico e imaging ad alta risoluzione. La tecnica richiede abilità manuale minimo, limitato soprattutto alla attenta smontaggio del sandwich vetro-mica-vetro (passo 2.8), che è essenziale per ottenere una superficie di mica alta qualità. Controllo della mica appena spaccati è sempre necessaria, a questo punto, poiché è possibile per la mica staccare dall'adesivo ottica senza fende, lasciando aree esposte…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori non hanno riconoscimenti.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Bath Sonicator | Fisher Scientific | FB15051 | |
| Coverslips 24 x 50mm – No H1.5 | Marienfeld | 102222 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850357 | |
| Hellmanex III (detergent) | Hellma Analytics | 320.003 | |
| Mica V-1 Grade | SPI Suppliers | 1872-CA | |
| Optical Adhesive (high viscosity) | Norland Products | NOA63 | |
| Optical Adhesive (low viscosity) | Norland Products | NOA60 | |
| Sphingomyelin-ATTO647N | AttoTec | AD 647N-171 | |
| UV lamp | Synoptics Ltd. | GelVue GVM20 | The lamp was set to 100% power |
Referências
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