Osteoclast Derivation fra Mouse Bone Marrow

Summary

Osteoklaster er den primære knogleresorberende celle i kroppen. En evne til at isolere osteoklaster i stort tal har resulteret i betydelige fremskridt i forståelsen af ​​osteoclast biologi. I denne protokol, beskriver vi en metode til isolering, dyrkning og kvantificere osteoklastaktivitet in vitro.

Abstract

Osteoklaster er højt specialiserede celler, der er afledt af monocyt / makrofag afstamning af knoglemarven. Deres enestående evne til at resorbere både organiske og uorganiske matricer af knogle betyder, at de spiller en central rolle i reguleringen af ​​skeletal remodeling. Sammen, osteoblaster og osteoklaster er ansvarlige for den dynamiske kobling proces, der involverer både knogleresorption og knogledannelse optræder sammen for at opretholde den normale skelet i sundhed og sygdom.

Som den primære knogleresorberende celle i kroppen, kan ændringer i osteoklastdifferentiering eller funktion resultere i dybtgående virkninger i kroppen. Sygdomme forbundet med ændret osteoklastfunktion kan variere i alvorlighed fra dødelig neonatal sygdom på grund af manglende dannelse af en marvrummet for hæmatopoiese, mere almindeligvis observeret patologier, såsom osteoporose, hvor overdreven osteoklastisk knogleresorption prædisponerer at bryde formationen.

ENT "> En evne til at isolere osteoklaster i stort tal in vitro har givet mulighed for betydelige fremskridt i forståelsen af knogleremodellering cyklus og har banet vejen for opdagelsen af nye terapeutiske strategier, der bekæmpe disse sygdomme.

Her beskriver vi en protokol til at isolere og dyrke osteoklaster fra mus knoglemarv, der vil give et stort antal osteoklaster.

Introduction

Knogleombygning er dynamisk og omfatter kobling af knogledannelse med knogleresorption ^1. Denne stramt reguleret proces er ansvarlig for at vedligeholde skelettet under normal homøostase, og som reaktion på skader og sygdom.

Osteoklaster er unikke, flerkernede celler, der er i stand til at resorbere både de organiske og uorganiske matrixer af knogle. Osteoklaster afledt af monocyt / makrofag afstamning af knoglemarven ^2-5. Abnormiteter i funktion eller dannelse af osteoklaster kan resultere i en række kliniske patologier, herunder almindelige tilstande som osteoporose.

Evnen til at generere osteoklaster in vitro har givet mulighed for betydelige fremskridt i vores forståelse af knogle biologi ^6. Som følge heraf er nye terapeutiske midler til behandling af begyndende osteoklastlignende sygdomme, der er ansvarlige for væsentlige morbiditet og dødelighed ⁷ </sop>. Homeostatisk vedligeholdelse af knoglemasse og styrke kræver samordnet indsats af knogledannende osteoblaster og knogleresorberende osteoklaster ^8,9. Knoglehomøostase ændres i en række sygdomme, herunder post-menopausal osteoporose, hvor den øgede osteoklastaktivitet fører til patogene tab af knoglemasse og densitet ^10. Med stigende tilgængelighed af transgene murine modeller af human sygdom, er der større mulighed for at dechifrere rolle osteoklaster i human knoglesygdom ^11-13.

Mange protokoller for osteoclast dyrkningsteknikker vises i litteraturen, med mange variationer beskrevet ^9,12,14. Xing og kolleger beskriver lignende metodologi til protokollen beskrevet nedenfor, i deres beskrivelse af osteoclastogenic analyser fra murine knoglemarvsceller. Dog at frigive knoglemarvsceller efter lang knogle høst, Xing et al. Skylle marvkavitetsareal med α-MEM komplette medier^14. Catalfamo undersøger effekten af hyperglykæmi på osteoklastfunktion og beskriver en fremgangsmåde, hvor alle celler tilvejebringes af knoglemarv skylning dyrkes i 24 timer, hvorefter de ikke-adhærente celler kasseres ^12, en teknik anvendes også af Boyle et al . ⁹ Disse tidligere offentliggjorte protokoller nødvendiggør praksis skylning knoglemarven, en kedelig praksis, som også medfører en risiko for en kanylestiklæsion og tab af værdifuld knoglemarv, som man skal skære begge ender af knoglen. Den protokol, som vi beskriver, gennemfører anvendelse af en morter og støder for at isolere osteoklaster, som svarer til fremgangsmåden ifølge makrofag isolation beskrevet af Weischenfeldt et al. ¹⁵

Vores erfaring, er imidlertid, at osteoklast isolation og in vitro kultur under anvendelse af tidligere offentliggjorte teknikker resulterer i variable resultater i form af osteoklast-produktion, hvilket ofte resultereri en manglende evne til at dyrke osteoklaster. Derfor har vi udviklet en protokol, der giver mulighed for ensartet isolering af muse knoglemarven til at producere store antal af flerkernede osteoclaster in vitro med et omtrentligt udbytte på 70-80% af cellerne oprindeligt belagt danner makrofager og derefter osteoklaster i nærvær af osteoklast induktion medier.

Protocol

BEMÆRK: Etisk erklæring: Al forskning, der involverer hvirveldyr blev udført i overensstemmelse protokoller godkendt af Stanford Administrative Panel om Laboratory Animal Care (Aplac). 1. Fremstilling Tillad 10 ml kommercielt tilgængelig densitetsgradient celleseparation medier (som indeholder polysucrose og natrium diatrizoat, justeret til en densitet på 1,077 g / ml) til at komme til stuetemperatur i en 50 ml konisk rør. Forbered flowcytometri (FACS) buffer med 1x phosphatpufret salt…

Representative Results

Formålet med denne fremgangsmåde var at let isolere et stort antal osteoklaster in vitro, typisk i en uge. Vellykket isolering af et stort antal osteoklaster blev bekræftet under anvendelse tartratresistent sur ​​phosphatase-farvning (figur 1A). Store osteoklaster visualiseres som store lilla celler med flere kerner (typisk ≥ 3 kerner). Anvendelse af denne protokol, er det almindeligt at isolere osteoklaster med så mange som 30 kerner per osteoclast (figur 1B). …

Discussion

En evne til let at isolere og dyrke store antal osteoklaster in vitro har været ansvarlig for at bidrage til at fremme forståelsen af knoglebiologien og osteoklast-medierede sygdomme. Det var identifikationen af RANKL, der fører til dette, da det blev for nylig identificeret som den vigtigste regulator af osteoklastdannelse, differentiering og overlevelse ^16-18.

Det har været vores erfaring, at in vitro dyrkning af osteoklaster fra knoglemarv er i vid udstræ…

Materials

Name of the Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
MEM, no glutamine, no phenol red	Gibco	51200-038
M-CSF, recombinant mouse	Gibco	PMC2044
Recombinant Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli expressed)	R&D Systems	462-TEC-010
Prostaglandin E2	Sigma-Aldrich
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771
Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit	Sigma-Aldrich	387A
Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates	Corning Life Sciences	3987