Osteoclast Utledning fra Mouse Bone Marrow

Summary

Osteoklaster er den viktigste ben-resorberende celle i kroppen. En evne til å isolere osteoklaster i store antall har resultert i betydelige fremskritt i forståelsen av osteoclast biologi. I denne protokollen, beskriver vi en metode for isolering, dyrking og kvantifisere osteoklastaktivitet in vitro.

Abstract

Osteoklaster er høyt spesialiserte celler som stammer fra monocytter / makrofagen avstamning av benmargen. Deres unike evne til å resorbere både organiske og uorganiske matriser av bein betyr at de spiller en viktig rolle i regulering av skjelett ombygging. Sammen, osteoblaster og osteoklaster er ansvarlig for den dynamiske sammenkoplingsprosess som involverer både benresorpsjon og bendannelse som virker sammen for å opprettholde normal skjelettet under helse og sykdom.

Som hoved ben-resorberende celle i kroppen, kan endringer i osteoklast differensiering eller funksjon resultere i dyptgripende virkninger i kroppen. Sykdommer assosiert med endret osteoklast-funksjon kan variere i alvorsgrad fra neonatal dødelig sykdom på grunn av manglende evne til å danne et marg plass for hematopoiese, mer vanlig observert patologier så som osteoporose, hvori overdreven osteoklastisk benresorpsjon predisponerer for å frakturere formasjonen.

ent "> En evne til å isolere osteoklaster i høye tall in vitro har åpnet for betydelige fremskritt i forståelsen av remodellesyklusen og har banet vei for oppdagelsen av nye terapeutiske strategier som bekjempe disse sykdommene.

Her beskriver vi en protokoll for å isolere og dyrke osteoklaster fra mus benmarg som vil gi et stort antall osteoklaster.

Introduction

Benremodelleringen er dynamisk og innebærer kobling av beindannelse med benresorpsjon ^en. Dette tett regulert prosessen er ansvarlig for å holde skjelettet under normal homeostase, og som respons på skade og sykdom.

Osteoklaster er unike, flerkjernede celler som er i stand til å resorberende både de organiske og uorganiske matriser av benet. Osteoklaster er utledet fra monocytt- / makrofag avstamning av benmargen ^2-5. Abnormaliteter i funksjon eller dannelse av osteoklaster kan resultere i en rekke kliniske patologi, herunder vanlige tilstander som osteoporose.

Evnen til å generere osteoklaster in vitro har åpnet for betydelige fremskritt i vår forståelse av bein biologi ^6. Som et resultat, er nye terapeutiske agenter dukker opp for å behandle osteoklast relaterte sykdommer som er ansvarlig for betydelige tilleggslidelser og dødelighet ⁷ </sopp>. Homeostatic vedlikehold av beinmasse og styrke krever samordnet aksjon av bendannende osteoblaster og bein-resorberende osteoklaster ^8,9. Bone homeostase endres på en rekke sykdommer, inkludert post-menopausal osteoporose, hvor øket osteoklast-aktivitet som fører til sykdomsfremkallende tap av benmasse og tetthet ^10. Med økende tilgjengelighet av transgene mus modeller av menneskelig sykdom, er det flere muligheter til å dechiffrere rolle osteoklaster i menneskelig skjelettsykdommer ^11-13.

Tallrike protokoller for osteoklast dyrkningsteknikker vises i litteraturen, med mange variasjoner er beskrevet ^9,12,14. Xing og medarbeidere beskriver metoden som er tilsvarende til den protokoll som er beskrevet nedenfor, i sin beskrivelse av osteoclastogenic assays fra murine benmargceller. Men å frigjøre benmargceller etter lang bein innhøsting, Xing et al. Skylle margen hulrom med α-MEM komplett media^14. Catalfamo undersøker effekten av hyperglycemi på osteoclast funksjon og beskriver en fremgangsmåte hvor alle celler mobilisert av benmargs spyling blir dyrket i 24 timer, ved hvilket punkt de ikke-adherente celler blir forkastet ^12, en teknikk som også brukes av Boyle et al . ^9. Disse tidligere publiserte protokoller nødvendiggjøre praktiseringen av spyle benmargen, en langtekkelig praksis, som også introduserer risikoen for en nålestikkskader og tap av verdifull benmarg, som man må kutte begge ender av benet. Protokollen, som vi beskrive, implementerer bruk av en morter og støter for å isolere osteoklaster, som er lik den fremgangsmåte som er beskrevet av makrofager isolert fra Weischenfeldt et al. ¹⁵

Vår erfaring er imidlertid at osteoclast isolasjon og in vitro kultur ved hjelp av tidligere publiserte teknikker resultater i variable resultater i form av osteoclast produksjon, som ofte resultereri en manglende evne til å dyrke osteoklaster. Vi har derfor utviklet en protokoll som muliggjør den konsekvente isolering av muse-benmarg til å produsere store antall osteoklaster multinucleated in vitro, med en omtrentlig utbytte på 70-80% av cellene i utgangspunktet belagt dannende makrofager og osteoklaster hvorpå, i nærvær av osteoclast induksjons medier.

Protocol

MERK: Etisk uttalelse: All forskning som involverer virveldyr ble utført i henhold protokoller godkjent av Stanford Administrative Panel on Laboratory Animal Care (APLAC). 1. Forberedelse Tillat 10 ml kommersielt tilgjengelig densitetsgradient celleseparasjonsmateriale (som inneholder polysucrose og natrium- diatrizoat, justert til en densitet på 1,077 g / ml) for å komme til romtemperatur i et 50 ml konisk rør. Forbered strømningscytometri (FACS) buffer med 1 x fosfatbufret saltløsnin…

Representative Results

Målet med denne fremgangsmåten var lett å isolere et stort antall osteoklaster in vitro, typisk i en uke. Vellykkede isolering av store antall osteoklaster ble bekreftet ved hjelp av tartrat-resistent sur-fosfatase-farging (figur 1A). Store osteoklaster er visualisert som store lilla celler med flere kjerner (typisk ≥ 3 kjerner). Ved hjelp av denne protokollen, er det vanlig å isolere osteoklaster med så mange som 30 kjerner per osteoclast (Figur 1b). <p class=…

Discussion

En evne til å enkelt isolere og dyrke et stort antall osteoklaster in vitro har vært ansvarlig for å bidra til å fremme forståelse av bein biologi og osteoklastmediert sykdommer. Det var identifikasjonen av RANKL som fører til dette, når det ble nylig identifisert som hovedregulator for osteoklastdannelse, differensiering og overlevelse ^16-18.

Det har vært vår erfaring at in vitro dyrking av osteoklaster fra benmarg er i stor grad avhengig av seeding tet…

Materials

Name of the Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
MEM, no glutamine, no phenol red	Gibco	51200-038
M-CSF, recombinant mouse	Gibco	PMC2044
Recombinant Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli expressed)	R&D Systems	462-TEC-010
Prostaglandin E2	Sigma-Aldrich
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771
Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit	Sigma-Aldrich	387A
Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates	Corning Life Sciences	3987