Fare Kemik İliği osteoklast türetilmesi
Summary
Osteoklastlar vücutta ana kemik-rezorbe hücresi vardır. Çok sayıda osteoklastlar izole etmek için bir yeteneği osteoklast biyoloji anlama konusunda önemli ilerlemelere yol açmıştır. Bu protokol, yetiştirilmesi ve in vitro olarak osteoklast aktivitesi miktarının, izole edilmesi için bir yöntem açıklanmaktadır.
Abstract
Osteoklastlar kemik iliği monosit / makrofaj türetilen çok özel hücreler bulunmaktadır. Kemiğin organik ve inorganik matrisler hem emmek üzere onların sağlıyor bu iskeletin yeniden modellenmesini düzenlenmesinde önemli bir rol oynadığı anlamına gelir. Birlikte, osteoblastlar ve osteoklastlar kemik erimesini ve sağlık ve hastalık sırasında normal iskeleti korumak için birlikte hareket eden kemik oluşumunu hem içeren dinamik bağlantı işlemi için sorumludur.
Vücutta ana kemik-rezorbe hücre olarak, osteoclast farklılaşmasında ve işlev değişikliklerin vücudun derin etkilere neden olabilir. Değiştirilmiş osteoklast fonksiyonuna bağlı hastalıklar, daha yaygın olarak, aşırı osteoklastik kemik erimesi oluşumunu kırılma yatkınlık olan osteoporoz, patolojileri gözlenen nedeniyle hematopoez için kemik iliği boşluk oluşturmak için başarısızlık öldürücü yenidoğan hastalığın şiddeti değişebilir.
ent "> in vitro yüksek sayılarda osteoklastlan izole etmek için bir yeteneği kemik yeniden çevriminin anlaşılması önemli gelişmeler için izin verdi ve bu hastalıklar ile mücadele yeni tedavi stratejilerinin keşif için yol açmıştır.Burada, izole edilmesi ve osteoklastların sayıda verecek fare kemik iliğinden osteoclastların yetiştirmek için bir protokol açıklar.
Introduction
Kemik remodeling dinamik ve kemik erimesinin 1 ile kemik oluşumu birleştirmesini kapsar. Bu sıkı düzenlenmiş süreç normal homeostasisin sırasında iskeleti korunmasından sorumlu olup, yaralanma ve hastalığa karşı.
Osteoklastlar kemik organik ve inorganik matris hem rezorbe yeteneğine sahip olan benzersiz sonunda, çok çekirdekli hücrelerdir. Osteoklastlar kemik iliği 2-5'in monosit / makrofaj elde edilir. Osteoklast fonksiyonuna veya oluşumundaki anormallikler osteoporoz gibi yaygın durumlar dahil olmak üzere klinik durumlar, çeşitli neden olabilir.
In vitro osteoklastlan oluşturmak için yeteneği kemik biyoloji 6 anlayışımızda önemli ilerlemeler sağladı. Bunun bir sonucu olarak, yeni terapötik maddeler, 7 önemli morbidite ve mortalite sorumlu olan osteoklast ile ilgili hastalıkların tedavisi için ortaya çıkmaktadır </s> kadar. Kemik kütlesi ve gücü homeostatik bakım kemik oluşturan osteoblast ve kemik osteoklastı 8,9 uyumlu eylem gerektirir. Kemik homeostazı burada osteoklast aktivitesi, kemik kütlesi ve yoğunluğu 10 patojenik kaybına yol açar artış, menopoz sonrası osteoporoz da dahil olmak üzere bir dizi hastalık, değiştirilir. İnsan hastalığı, transgenik fare modelleri artmasıyla, insan kemik hastalığı 11-13 osteoklastların rolünü deşifre için daha fazla olanak vardır.
Birçok varyasyon 9,12,14 anlatılmış olan osteoklast kültür teknikleri için çeşitli protokoller, literatürde yer almaktadır. Xing ve arkadaşları, fare kemik iliği hücrelerinden osteoclastogenic deneylerinin açıklamasında, aşağıda tarif edilen protokole benzer bir metodoloji tarif eder. Ancak uzun kemik hasat sonrası kemik iliği hücreleri çıkarmak için, Xing vd. Α-MEM tam ortam ile ilik boşluğu yıkayın14. Catalfamo, osteoklast fonksiyonuna hipergliseminin etkisini inceleyen ve hücreler, kemik iliği yıkama ile harekete geçirilen bir yöntem olup, en yapışmayan hücreler 12 atılır etmektedir, 24 saat boyunca kültürlenir tarif da Boyle ve diğerleri tarafından kullanılan bir tekniktir . 9 Bunlar daha önce yayınlanan protokolleri tek bir kemiğin iki ucunu kesmek gerekir aynı zamanda, bir iğne batması ve değerli kemik iliği kaybı riski tanıtır kemik iliği, sıkıcı bir uygulama, kızarma uygulamasını zorunlu kılmaktadır. Biz tarif protokolü, Weischenfeldt ve diğerleri tarafından tarif makrofaj izolasyon yöntemine benzer osteoklastlar izole etmek için bir havan ve tokmak kullanımını uygular. 15
Bizim deneyim, ancak, genellikle elde edilen, osteoklast üretimi açısından değişik sonuçlar, daha önce yayınlanmış teknikleri sonuçlarını kullanarak bu osteoklast izolasyonu ve in vitro kültür içindebir yetersizlik osteoklastlan yetiştirmek için. Bu nedenle, varlığında, ilk olarak makrofajlar ve daha sonra osteoklastlar oluşturan kaplama hücrelerinin% 70-80 yaklaşık verim ile in vitro olarak çok çekirdekli osteoklastlar çok sayıda üretmek üzere fare kemik iliği tutarlı izolasyonu sağlayan bir protokol tasarladılar osteoklast indüksiyon medya.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kolayca in vitro osteoklastlann sayıda izole ve yetiştirmek için bir yetenek kemik biyoloji ve osteoklast-aracılı hastalıkların anlayışı ilerletmek için yardımcı sorumlu olmuştur. Son zamanlarda osteoklast formasyonu, farklılaşma ve canlılık 16-18 başlıca düzenleyicisi olarak tespit edilmiştir zaman, bu yol RANKL ayırdedilebilmesidir.
Kemik iliği osteoclastların in vitro kültürü ekim yoğunluğu büyük ölçüde bağımlı olan bizim …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz NIH hibe R01 DE021683, R01 DE019434, U01 HL099776, Oak Vakfı ve Pediatrik Rejeneratif Tıp Hagey Laboratuvarı destek için minnettarım.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| MEM, no glutamine, no phenol red | Gibco | 51200-038 | |
| M-CSF, recombinant mouse | Gibco | PMC2044 | |
| Recombinant Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli expressed) | R&D Systems | 462-TEC-010 | |
| Prostaglandin E2 | Sigma-Aldrich | ||
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates | Corning Life Sciences | 3987 |
Referências
- Sims, N. A., Martin, T. J. Coupling the activities of bone formation and resorption: a multitude of signals within the basic multicellular unit. BoneKEy reports. 3, 481 (2014).
- Kahn, A. J., Simmons, D. J. Investigation of cell lineage in bone using a chimaera of chick and quial embryonic tissue. Nature. 258, 325-327 (1975).
- Walker, D. G. Bone resorption restored in osteopetrotic mice by transplants of normal bone marrow and spleen cells. Science. 190, 784-785 (1975).
- Burger, E. H., et al. In vitro formation of osteoclasts from long-term cultures of bone marrow mononuclear phagocytes. The Journal of experimental medicine. 156, 1604-1614 (1982).
- Underwood, J. C. From where comes the osteoclast. The Journal of pathology. 144, 225-226 (1984).
- Lacey, D. L., et al. Bench to bedside: elucidation of the OPG-RANK-RANKL pathway and the development of denosumab. Nature reviews. Drug discovery. 11, 401-419 (2012).
- Brown, J. E., Coleman, R. E. Denosumab in patients with cancer-a surgical strike against the osteoclast. Nature reviews. Clinical oncology. 9, 110-118 (2012).
- Khosla, S. Minireview: the OPG/RANKL/RANK system. Endocrinology. 142, 5050-5055 (2001).
- Boyle, D. L., et al. Differential roles of MAPK kinases MKK3 and MKK6 in osteoclastogenesis and bone loss. PloS one. 9, (2014).
- Hofbauer, L. C., Heufelder, A. E. Role of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand and osteoprotegerin in bone cell biology. Journal of molecular medicine (Berlin, Germany). 79, 243-253 (2001).
- Teramachi, J., et al. Increased IL-6 Expression in Osteoclasts is Necessary but not Sufficient for the Development of Paget’s Disease of Bone. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. , (2013).
- Catalfamo, D. L., et al. Hyperglycemia induced and intrinsic alterations in type 2 diabetes-derived osteoclast function. Oral diseases. 19, 303-312 (2013).
- Schueler, J., et al. Intratibial injection of human multiple myeloma cells in NOD/SCID IL-2Rgamma(null) mice mimics human myeloma and serves as a valuable tool for the development of anticancer strategies. PloS one. 8, (2013).
- Xing, L., Boyce, B. F. RANKL-Based Osteoclastogenic Assays from Murine Bone Marrow Cells. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 1130, 307-313 (2014).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH protocols. , (2008).
- Yamamoto, Y., et al. Osteoblasts provide a suitable microenvironment for the action of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand. Endocrinology. 147, 3366-3374 (2006).
- Yasuda, H., et al. Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3597-3602 (1998).
- Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93, 165-176 (1998).
- Teitelbaum, S. L., Ross, F. P. Genetic regulation of osteoclast development and function. Nature reviews. Genetics. 4, 638-649 (2003).
- Agas, D., Sabbieti, M. G., Marchetti, L. Endocrine disruptors and bone metabolism. Archives of toxicology. 87, 735-751 (2013).
- Manolagas, S. C., O’Brien, C. A., Almeida, M. The role of estrogen and androgen receptors in bone health and disease. Nature Reviews Endocrinology. 9, 699-712 (2013).
- Martin, T. J., Udagawa, N. Hormonal regulation of osteoclast function. Trends in endocrinology and metabolism. 9, 6-12 (1998).
- Nakamura, T., et al. Estrogen prevents bone loss via estrogen receptor alpha and induction of Fas ligand in osteoclasts. Cell. 130, 811-823 (2007).
- Bellido, T., et al. Regulation of interleukin-6, osteoclastogenesis, and bone mass by androgens. The role of the androgen receptor. The Journal of clinical investigation. 95, 2886-2895 (1995).
- Roato, I. Interaction among cells of bone, immune system, and solid tumors leads to bone metastases. Clinica., & developmental immunology. 2013, (2013).
- Autio, K. A., Morris, M. J. Targeting bone physiology for the treatment of metastatic prostate cancer. Clinical advances in hematolog., & oncology. 11, 134-143 (2013).
- Sottnik, J. L., Keller, E. T. Understanding and targeting osteoclastic activity in prostate cancer bone metastases. Current molecular medicine. 13, 626-639 (2013).
