Application de nanoparticules fluorescentes pour étudier Rénovation du système Endo-lysosomale par des bactéries intracellulaires
Summary
Cet article décrit les méthodes pour la synthèse et le marquage fluorescent de nanoparticules (NP). Les IP ont été appliquées dans des expériences pulse-chase d'étiqueter le système endo-lysosomale des cellules eucaryotes. La manipulation du système d'endo-lysosomal par les activités de l'agent pathogène intracellulaire Salmonella enterica ont été suivis par imagerie des cellules vivantes et quantifiée.
Abstract
Nanoparticules fluorescentes (IP) avec des propriétés optiques et mécaniques et chimiques souhaitables, sont des outils prometteurs pour étiqueter organites intracellulaires. Ici, nous introduisons une méthode utilisant or-BSA-rhodamine IP d'étiqueter le système de cellules eucaryotes endo-lysosomale et surveiller manipulations des voies cellulaires de l'hôte par le pathogène intracellulaire Salmonella enterica. Les IP ont été facilement internalisées par les cellules HeLa et localisées à la fin des endosomes / lysosomes. Infection à Salmonella réarrangement des vésicules et l'accumulation des IP dans les structures membranaires Salmonelle induites induit. Nous avons déployé le progiciel Imaris pour des analyses quantitatives des images de microscopie confocale. Le nombre d'objets et de leur distribution de taille dans les cellules non infectées étaient distinctes de celles dans les cellules infectées par Salmonella, indique une très remodelage du système endo-lysosomale par WT Salmonella.
Introduction
Nanoparticules fluorescentes (IP), y compris IP métalliques, points quantiques, IP, IP polymères de silice, des points de carbone, etc., ont attiré une attention considérable au cours des dernières décennies 1,2. Par rapport à des colorants organiques traditionnels, les IP fluorescents montrent chimiques, des propriétés optiques et mécaniques souhaitables, telles que la résistance forte du signal, la résistance au photoblanchiment et haut de 3,4 biocompatibilité. Ces avantages en font la méthode de choix pour la détection intracellulaire et imagerie des cellules vivantes. En outre, une variété de IP denses aux électrons sont visibles en microscopie électronique (EM), ce qui facilite leur utilisation pour l'analyse microscopique corrélée, qui permet combinaison de suivi en microscopie optique (LM) et une résolution supérieure au niveau ultrastructural avec EM 5 cellules vivantes. Par exemple, les IP or ont été longtemps utilisé efficacement comme biocapteurs pour le diagnostic dans les cellules sensibles vie ainsi que dans le domaine de l'immuno-marquage 6. S récentses études indiquent que les IP or avec la taille et de forme différentes peuvent être facilement absorption par une grande variété de lignées de cellules et de transporter régulièrement par la voie endosomale, ont donc grand potentiel étant appliquée pour le suivi du transport des vésicules intracellulaires et l'étiquetage du système endo-lysosomale 7,8 .
Les pathogènes microbiens, tels que Salmonella enterica, Shigella flexneri et Listeria monocytogenes, ont développé des mécanismes différents pour envahir les cellules hôtes non-phagocytaires neuf. Après avoir été intériorisé, les agents pathogènes, soit localisées dans le cytosol ou séquestrés dans les compartiments membranaires, interagissent beaucoup avec leur environnement d'accueil et les moduler pour favoriser leur propre survie 10. Par exemple, Salmonella enterica réside et se multiplie dans un phagosome intracellulaire appelé la vacuole contenant Salmonella (SCV) lors de l'infection 11. Le SCV maturationtrafics vers l'appareil de Golgi, subissant interactions continues avec la voie d'endocytose, et induit la formation de vastes structures tubulaires, tels que Salmonella filaments induites (SIF), le tri tubules nexine, Salmonella induite porteuses de sécrétion des protéines de la membrane 3 (SCAMP3) tubules, etc. . 12-14. Étudier comment ces agents pathogènes bactériens manipuler voies cellule hôte est essentielle pour comprendre les maladies infectieuses.
Ici, NP or-BSA-rhodamine ont été utilisés comme marqueurs de fluide pour marquer le système endo-lysosomal cellulaire hôte et l'agent pathogène gastro-intestinal Salmonella enterica sérovar Typhimurium humain (Salmonella) a été utilisé comme une bactérie modèle pour étudier les interactions de l'agent pathogène avec le accueillir voie d'endocytose. Intracellulaires IP or BSA-rhodamine dans les cellules et les cellules non infectées infectés par Salmonella WT ou souches mutantes ont été imagées par un microscope confocal à balayage laser (CLSM).Puis logiciels Imaris a été utilisée pour quantifier la distribution des IP, ce qui indique que l'infection à Salmonella induit extrême réarrangement des endosomes / lysosomes. Après la description de cette méthode, des expériences analogues peuvent être conçus pour suivre devenir à long terme des IP intériorisés et d'étudier l'influence de diverses substances exogènes ou facteurs endogènes sur la voie d'endocytose des cellules eucaryotes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le système endo-lysosomal de cellules de mammifère contrôle les processus physiologiques importants, y compris l'absorption des nutriments, l'hormone de la transduction du signal à médiation par, la surveillance immunitaire et la présentation de l'antigène 17. Jusqu'à présent, divers marqueurs ont été utilisés pour le marquage des études de la voie d'endocytose et de suivi. Par exemple, les sondes sont des sondes d'Lysotracker acidotropic fluorescents mis au point par Mole…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft by grant Z within Sonderforschungsbereich 944 ‘Physiology and Dynamics of Cellular Microcompartments’ and HE1964/18 within priority program 1580.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| Gold chloride | Sigma-Aldrich | 520918 | |
| Tannic acid | Sigma-Aldrich | 403040 | |
| tri-sodium citrate | Sigma | C8532 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
| NHS-Rhodamine | Pierce | 46406 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Gentamicin | Applichem | A1492 | |
| Kanamcyin | Roth | T832 | |
| Carbenicillin | Roth | 6344 | |
| 8-well chamber slides | Ibidi | 80826 | tissue culture treated, sterile |
| Imaris Software | Bitplane | version 7.6 | various configurations available |
Referências
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