Anvendelse av Fluorescent Nanopartikler å studere Omforming av det Endo-lysosomal System av intracellulære bakterier

Summary

Denne artikkelen beskriver fremgangsmåter for syntese og fluorescerende merking av nanopartikler (NPS). NPS ble brukt i puls-chase eksperimenter å merke endo-lysosomal system av eukaryote celler. Manipulering av endo-lysosomal system av aktiviteter av den intracellulære patogen Salmonella ente ble etterfulgt av levende celle bildebehandling og kvantifisert.

Abstract

Fluorescent nanopartikler (NPS) med ønskelig kjemiske, optiske og mekaniske egenskaper er lovende verktøy å merke intracellulære organeller. Her introduserer vi en metode med gull-BSA-NPs å merke endo-lysosomal system av eukaryote celler og overvåke manipulasjoner av vertscelle pathways av den intracellulære patogen Salmonella ente. NPS ble lett internalisert av HeLa celler og lokalisert i sene endosomer / lysosomer. Salmonella infeksjon indusert omorganisering av blemmer og opphopning av NPs i Salmonella- indusert membranstrukturer. Vi rullet ut Imaris programvarepakke for kvantitative analyser av konfokalmikroskopi bilder. Antall objekter og deres distribusjons størrelse i ikke-infiserte celler var forskjellig fra de i Salmonella -infected celler, noe som indikerer ekstremt ombygging av endo-lysosomal system av WT Salmonella.

Introduction

Fluorescent nanopartikler (NPS), inkludert metall NPs, kvanteprikker, polymer NPs, silika NPs, karbon punktum, etc., har vakt betydelig oppmerksomhet i løpet av de siste tiårene ^1,2. Sammenlignet med tradisjonelle organiske fargestoffer, fluorescerende NPs viser ønskelig kjemiske, optiske og mekaniske egenskaper, som for eksempel sterk signalstyrke, motstand mot fotobleking og høy biokompatibilitet ^3,4. Disse fordelene gjør dem metoden for valg for intracellulær sensing og levende celle bildebehandling. Videre en rekke elektrontette NPs er synlige ved elektronmikroskopi (EM), tilrettelegging for deres bruk for korrelert mikroskopisk analyse, som tillater kombinasjon av levende celle sporing med lysmikroskopi (LM) og høyere oppløsning på ultrastructural nivå med EM ^5. For eksempel har gull NPS vært lang tid effektivt anvendes som biosensorer i levende celler for sensitiv diagnostisering så vel som i felten av immun-merking ^6. Nylige studies indikerer at gull NPS med forskjellig størrelse og form kan være lett opptak av et stort utvalg av cellelinjer og rutinemessig transporteres gjennom endosomale veien, har derfor et stort potensial som påføres for intracellulær transport vesikkel sporing og systemet merking ^endo-7,8 lysosomal .

Mikrobielle patogener, som Salmonella ente, Shigella flexneri og Listeria monocytogenes, har utviklet ulike mekanismer for å invadere ikke-fagocyttiske vertsceller ^9. Etter å ha blitt internalisert, patogener, enten lokalisert i cytosol eller inne i de membranbundne avdelinger, samhandle mye med sine vertsmiljøer og modulere disse til å favorisere sin egen overlevelse ^10. For eksempel ligger Salmonella ente og replikerer innenfor en intracellulær phagosomal rommet kalt Salmonella-holdige vakuole (SCV) ved infeksjon ^11. Modning SCVtraffics mot Golgi-apparatet, gjennomgår kontinuerlige interaksjoner med endocytoseveien, og induserer dannelsen av omfattende rørformede strukturer, slik som Salmonella indusert filamenter (SIF), sortering nexin tubuli, Salmonella -indusert sekretorisk carrier membran protein 3 (SCAMP3) tubuli, etc . ^12-14. Studere hvordan disse bakterielle patogener manipulere vertscelle veier er viktig for forståelse av smittsomme sykdommer.

Her ble gull-BSA-rhodamin NPS anvendt som fluid tracere for å merke vertscelle endo-lysosomal systemet, og den humane mage-patogen Salmonella enterica serovar Typhimurium (Salmonella) ble anvendt som en modell for å studere bakterie interaksjoner av patogenet med vert endocytoseveien. Intracellulære gull-BSA-NPs i ikke-infiserte celler og celler infisert med WT Salmonella eller mutantstammer ble fotografert av et konfokal laser-scanning mikroskop (CLSM).Deretter Imaris programvare ble benyttet for å kvantifisere fordelingen av NPS, noe som viser at Salmonella-infeksjon indusert ekstrem omleiring av endosomer / lysosomer. Etter beskrivelsen av denne metoden, kan analoge eksperimenter være utformet for å spore langvarig skjebnen til de internalis NPS og for å undersøke innflytelsen av forskjellige eksogene stoffer eller endogene faktorer på endocytoseveien av eukaryote celler.

Protocol

1. Syntese av 10 nm Gold Nanopartikler (Gold NPs) 15 Forbered løsning A: tilsett 2 ml 1% vandig gull klorid i 160 ml Milli-Q, eller dobbelt destillert vann. Forbered oppløsning B: Tilsett 8 ml 1% tri-natriumcitrat x 2 H2O og 160 pl 1% Garvesyre i 32 ml Milli-Q eller dobbelt-destillert, vann. Varm opp løsning A og B til 60 ° C og bland dem under omrøring. Observere en mørk blå farge umiddelbart. Observere rød farge etter ca 15 min. Deretter varmes opp til 95 °…

Representative Results

Gull NPs ble generert gjennom en veletablert metode via reduksjon av chloroauric syre ved citrate og garvesyre. Som vist i figur 2A, de syntetiserte gull NPS var kvasi-sfærisk form med en størrelse på ca 10 nm. BSA-belegg og rodamin-merking ikke påvirke deres morfologi eller størrelse (figur 2B). Det har blitt rapportert at gull NPs kan lett tas opp av ulike pattedyrceller og endte opp i endocytiske systemer 7. I samsvar med tidligere arbeide…

Discussion

Endo-lysosomal system av pattedyrceller styrer viktige fysiologiske prosesser, herunder næringsopptak, hormon-mediert signaltransduksjon, immun overvåking, og antigenpresentasjon ^17. Opp til nå, har en rekke markører vært brukt til merking av endocytoseveien og sporing studier. For eksempel, LysoTracker sonder er fluorescerende acidotropic prober utviklet av molekylære prober (Life Technologies, USA) for lysosome merking, som kan selektivt akkumuleres i mobilnettet lommer med lav indre pH og effektivt e…

Materials

Name of the Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/ Description
Gold chloride	Sigma-Aldrich	520918
Tannic acid	Sigma-Aldrich	403040
tri-sodium citrate	Sigma	C8532
Bovine serum albumin	Sigma	A2153
NHS-Rhodamine	Pierce	46406
DMSO	Sigma	D8418
HEPES	Sigma	H3375
Gentamicin	Applichem	A1492
Kanamcyin	Roth	T832
Carbenicillin	Roth	6344
8-well chamber slides	Ibidi	80826	tissue culture treated, sterile
Imaris Software	Bitplane	version 7.6	various configurations available