Quantificação de Orofacial nos fenótipos Xenopus

Resumo

Um método para quantificar o tamanho e forma orofacial de embriões de Xenopus laevis foi desenvolvido. Neste protocolo, as medições de tamanho tradicional são combinados com morfometria geométrica para permitir análises mais sofisticadas de desenvolvimento orofacial e defeitos.

Resumo

Xenopus tornou-se uma ferramenta importante para dissecar os mecanismos que regem o desenvolvimento craniofacial e defeitos. Um método para quantificar o desenvolvimento orofacial irá permitir uma análise mais rigorosa dos fenótipos orofaciais mediante revogação com substâncias que podem manipular geneticamente ou molecularmente a expressão do gene ou a função da proteína. Usando imagens bidimensionais dos chefes embrionárias, dimensões, tais como tamanho tradicional orofacial largura, altura e área- são medidos. Além disso, uma medida de arredondamento da abertura da boca embrionária é usada para descrever a forma da boca. Morfometria geométrica destes dois imagens tridimensionais também é executada para fornecer uma visão mais sofisticada de mudanças na forma da região orofacial. Marcos são atribuídos a pontos específicos na região orofacial e coordenadas são criados. A análise de componentes principais é usada para reduzir coordenadas marco para componentes principais que, em seguida, discriminam o tratamentogrupos. Estes resultados são exibidos como um gráfico de dispersão em que os indivíduos com formas orofaciais semelhantes se agrupam. Também é útil para executar uma análise da função discriminante, que compara estatisticamente as posições dos pontos de referência de entre dois grupos de tratamento. Esta análise é apresentada em uma grade transformação, onde mudanças na posição do marco são vistos como vetores. A grade é sobreposto a estes vetores para que um padrão de deformação é exibido para mostrar onde as posições marco significativas mudaram. As mudanças de forma na análise da função discriminante baseiam-se numa medida estatística, e, por conseguinte, pode ser avaliada por um valor de p. Esta análise é simples e acessível, necessitando apenas de um estereoscópio e software freeware, e, portanto, será um recurso valioso de pesquisa e ensino.

Introdução

Entre os tipos mais prevalentes e devastadores de defeitos congênitos humanos são aqueles que afetam a boca e face, tais como fendas orofaciais ^um. Crianças com estruturas orofaciais malformados passar por várias cirurgias ao longo da sua vida e luta com desfigurações faciais, voz, audição e problemas alimentares. Portanto, facilitando novas pesquisas no desenvolvimento crânio-orofacial e é fundamental para a prevenção e tratamento destes tipos de defeitos congênitos em humanos. Xenopus laevis surgiu como uma nova ferramenta para dissecar os mecanismos que regem o desenvolvimento craniofacial (alguns exemplos incluem ^{2,3,4 -11).} Portant....

Protocolo

Todos os experimentos realizados utilizando Xenopus laevis foram aprovados pelo IACUC (protocolo nº AD20261).

1. Reagentes Preparar e materiais necessários

1. Reagentes:
   1. Faça 1 L de 10x MBS (Modificado salinos de Barth) solução ^22. Adicionar NaCl (880 mM), KCl (10 mM), _MgSO4 (10 mM), HEPES (50 mM, pH 7,8), e _NaHCO3 (25 mM) a 1 L de água destilada. Ajustar o pH para 7,8 com NaOH.
   2. Adicione 1 L de 1x MBS diluindo 100 ml de 10x MBS solução em 900 ml de água destilada. Adicionar 0,7 ml de uma solução M de _CaCl2.
   3. Adicione 1 L de MBS 0,1x diluindo 100 ml de....

Resultados

Aqui, foi demonstrada uma análise quantitativa do tamanho e forma orofacial para comparar os embriões tratados com um inibidor do receptor do ácido retinóico (RAR inibidor) a controlos não tratados. Os embriões foram tratados com uma concentração de 1 uM de inibidor químico esta fase de 24 a 30 anos (26-35 hpf), lavou-se para fora, e fixado em fase 42 (82 hpf). Eles foram, em seguida, processada e analisada como descrito no protocolo. Os resultados são dados originais, mas consistente com as observações em publicações a.......

Discussão

Xenopus laevis tornou-se uma ferramenta útil para dissecar os mecanismos de desenvolvimento de desenvolvimento orofacial subjacente; no entanto, atualmente não há protocolos que descrevem tamanho e forma as mudanças desta região em sapos. O método aqui descrito vai contribuir significativamente para o campo do desenvolvimento orofacial, permitindo a quantificação mais rigorosa dos fenótipos orofaciais em Xenopus e outros vertebrados.

O primeiro aspecto, mais crítico de exec.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microscópio de dissecação	Zeiss		equipado com câmera AxioCamICC1
Dumont #5 Pinça de inox	Fine Science Tools	11251-10
Bisturi estéril e descartável	Sklar	06-2015
Placa de 24 poços	Fisher Scientific	087721
Standard Pipetas de transferência descartáveis	Fisher Scientific	13-711-7M
Placas de Petri de 150 mm x 15 mm	Falcon	351058
Incubadoras	Ectoterma		ajustadas para 15 &graus; C ou 20 & C
Argila de modelagem	Premo, ou outra argila		em preto ou branco
Agulha de provocação reta	Thermo Scientific	19010
Tubo capilar (para agulhas)	FHC	30-30-1	Borosil 1,0 mm OD x 0,5 mm ID/Fibra, 100 mm cada
Extrator de agulha, Modelo P-97	Sutter Instrument Co.	Extrator de agulhas: P-97 Extrator de micropipeta flamejante/bown Filamento: FB300B	Para filamentos, use filamentos de caixa quadrada Sutter de 3,00 mm, 3,0 mm de largura.
Pipetadores	Gilson	F144802, F123600, F123602
BMS-453	Tocris	3409
DMSO	American Bioanalytical	AB00435-01000
Cisteína	Sigma-Aldrich	52-90-4
Paraformaldeído em pó	Sigma-Aldrich	158127
placas de Petri	Falcom	353003, 351058	100 mm de diâmetro e 150 mm de diâmetro
100% etanol	VWR	89125-170

de modelagem não tóxica