شريحة ساخنة: الكبار الدماغ الحاد في درجة الحرارة الفسيولوجية التقطيع
Summary
In this paper we show a method for preparing acute brain slices in physiological temperature, using a conventional physiological solution without special modifications for the cutting (such as adding sucrose) and without intracardial perfusion of the animal before slice preparation.
Abstract
هنا نقدم بروتوكول لإعداد شرائح الدماغ الحادة. هذا الإجراء هو عنصر حاسم للتجارب الكهربية التصحيح، المشبك الذي يحدد إلى حد كبير على نوعية النتائج. وقد تبين أن إهمال خطوة التبريد أثناء إجراء خفض مفيد في الحصول على شرائح السليمة والخلايا، وخاصة عند التعامل مع الهياكل الدماغ مياليني للغاية من الحيوانات الناضجة. على الرغم من أن الآلية الدقيقة حيث تدعم درجة حرارة مرتفعة لا يمكن تكهن على الصحة العصبية، فإنه من المعقول أنه كلما أمكن، يجب أن تكون درجة الحرارة التي يتم فيها إجراء تشريح قريبة من الظروف الفسيولوجية لمنع التحف درجات الحرارة ذات الصلة. وثمة ميزة أخرى مهمة لهذه الطريقة هي بساطة الإجراء، وبالتالي فإن الوقت اللازم لإعداد قصيرة. في طريقة أثبتت تستخدم الفئران البالغين ولكن يمكن تطبيق نفس الإجراء مع الفئران الأصغر سنا وكذلك الفئران. أيضا، فإن البنود التالية التصحيحيتم تنفيذ التجربة أمبير على شرائح أفقية للدماغ، ولكن يمكن أيضا أن تستخدم نفس الإجراء في الطائرات الأخرى، وكذلك المناطق الخلفية أخرى من الدماغ.
Introduction
والهدف من هذه الطريقة هو الحصول على عرض ذات جودة عالية شرائح الدماغ الحادة في المختبر لتجارب الكهربية، خاصة عند استخدام البالغين أو حتى الحيوانات القديمة.
طريقة الحاد تشريح الدماغ، كما وصفها Skrede وWestgaard 1 في جملتين أنيقة، وأصبحت واحدة من أسس علم الأعصاب الحديث الأبحاث ويعمل في الاختلافات التي لا حصر لها في جميع أنحاء العالم. وينعكس على نوعية الشرائح في عدد الخلايا العصبية في شريحة الحية، والفترة الزمنية التي تبقي الخلايا الكهربية وخصائصها المورفولوجية وكذلك في سلامة الأنسجة. وعلاوة على ذلك، فإن المدة القصوى للتسجيلات مستقرة تعتمد على نوعية الشرائح. وبالتالي، على طول العقود، وطريقة التقطيع الأصلي تم تطويرها من قبل مجموعات بحثية فردية لتعزيز الانتعاش بعد قطع شريحة 10/02، في كثير من الأحيان التعديلات المعقدة لتشكيل قطع سحلول التعافي ص (مثل إضافة أسكوربات، ثيوريا أو حتى H 2 O 2) وكذلك داخل القلب قبل نضح من الحيوان مع حلول تبريد الفسيولوجية.
كما ثبت مؤخرا 11، ويبدو أن درجة حرارة الفسيولوجية أثناء التقطيع لتكون أكثر فائدة من التبريد لصحة الخلايا العصبية. التحسن هو الأكثر لفتا عند العمل مع الكبار (2-8 أشهر) القوارض. تجنب التغيرات في درجات الحرارة مثيرة يمنع القطع الأثرية بسبب العمليات التي تعتمد على درجة الحرارة في الخلايا، مثل اللدونة 13 و ايون قنوات حركية 13،14. مثل هذه التغييرات يمكن أن تؤثر على غشاء الجهد وإشارات الكالسيوم داخل الخلايا، عتبة السنبلة، وسنبلة الشكل.
و"الساخنة" طريقة إعداد شريحة الحادة المقدمة هنا هو إجراء عام للحصول على جودة عالية شرائح الدماغ الحادة من أي منطقة في الدماغ، بما في المخيخ والقشرة والحصين، الدماغ نوى 16 </ سوب> وكذلك البصلة الشمية، سواء في الجرذان والفئران.
خصوصا، يتطلب إجراء تشريح درجة حرارة الفسيولوجية التي شفرة قطع يهتز تقريبا تماما أفقيا وهي دون أي عيوب هيكلية. هذه الدقة قد لا يكون ممكن مع النماذج القديمة تقطيع اللحم. في مثل هذه الحالات، ونحن ننصح أداء إعداد شريحة في ظروف البرد القارص كما يبدو على درجة حرارة منخفضة لجعل النسيج أكثر مقاومة للأضرار الميكانيكية، حتى لو كان على حساب الانحرافات الأيضية.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن لشرح طريقة لإعداد شرائح الدماغ الحادة من الفئران في الفسيولوجية بدلا من درجة حرارة الجليد الباردة.
فقد تبين أن 11 نوعية الشرائح التي تم الحصول عليها في الظروف الحارة متفوقة بالمقارنة مع تلك التي أعدت مع الظروف الباردة، ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to acknowledge the significant contribution Dr. Shiwei Huang (Australian National University) in validating the method. Furthermore, we would like to thank Ms. Kasia Pietrajtis for helpful comments regarding Golgi cells and Mr. Vitaly Lerner for the cortex experimental data. This work was supported by PITN-GA-2009-238686 (CEREBNET), FP7-ICT (REALNET), ELSC and ISF.
Materials
| Name | Company | Catalog # | Comments |
| Pentobarbital | CTS | 170066 | Concentration: 60 mg / ml in physiological saline. |
| Big scissors | FST | 14001-16 | Any large scissors or a guillotine with sufficiently sharp edges can be used for decapitation |
| Iris scissors | Prestige medical | 48,148 | Any fine tip scissors can be used, provided the scissor blades are not longer than 1.5 – 2 cm |
| Fine tip forceps | FST | 11254-20 | |
| Scalpel | FST | 91003-12 | |
| Scalpel blade #11 | FST | 10011-00 | |
| Small spatula | Fisher | 2350 | |
| Filter paper | Any laboratory brand can be used. | ||
| Petri dishes | Duroplan | Z231509-1 | |
| Glass beakers | SCHOT | 10022846 | |
| Pasteur pipette | Maple Leaf Brand | 14672-029 | |
| Super glue | LOCTITE | 4091361/1 | |
| Slicer | Campden | 7000-smz | |
| Ceramic slicing blade | Campden | 7550-1-C | |
| Magnetic heater/stirrer | For heating up the SPS for the procedure | ||
| Electric kettle | For heating up water for temperature control | ||
| Slice recovery chamber + heating unit | Warner instruments | BSC-HT + BSC-BUW | Home-built models may also be used. |
| Thermometer | For monitoring SPS temperature during dissection and slicing |
Referências
- Skrede, K., Westgaard, R. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Research. 35, 589-593 (1971).
- Aghajanian, G., Rasmussen, K. Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices. Synapse. 3, 331-338 (1989).
- Gueritaud, J. Electrical activity of rat ocular motoneurons recorded in vitro. Neurociência. 24, 837-852 (1988).
- Lipton, P., et al. Making the best of brain slices: comparing preparative methods. Journal of Neuroscience Methods. 59, 151-156 (1995).
- Richerson, G., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Experimental Neurology. 131, 133-143 (1995).
- Brahma, B., Forman, R., Stewart, E., Nicholson, C., Rice, M. Ascorbate inhibits edema in brain slices. Journal of Neurochemistry. 74, 1263-1270 (2000).
- Moyer, J. R., Brown, T. H. Patch-clamp techniques applied to brain slices. In: Patch-clamp analysis: advanced techniques. Springer. , 135-193 (2002).
- Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons. J. Neuroscience Methods. 156, 251-259 (2006).
- Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).
- Zhao, S., et al. Cell type–specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8, 745-752 (2011).
- Huang, S., Uusisaari, M. Y. Physiological temperature during brain slicing enhances the quality of acute slice preparations. Front. Cell. Neurosci. 7, (2013).
- Ohe, G. C., Darian-Smith, C., Garner, C. C., Heller, H. C. . The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10590-10598 (2006).
- Voets, T., et al. The principle of temperature-dependent gating in cold- and heat-sensitive TRP channels. Nature. 430, 748-754 (2004).
- Coulter, D. A., Huguenard, J. R., Prince, D. A. Calcium currents in rat thalamocortical relay neurones: kinetic properties of the transient, low-threshold current. The Journal of Physiology. 414, 587-604 (1998).
- Gibb, A. J., Edward, F. A. Patch clamp recording from cells in slice tissues. Microelectrode Techniques: the Plymouth workshop handbook. , (1994).
- Lefler, Y., Yarom, Y., Uusisaari, M. Y. Cerebellar Inhibitory Input to the Inferior Olive Decreases Electrical Coupling and Blocks Subthreshold Oscillations. Neuron. 81 (6), 1389-1400 (2014).
- Bourne, J. N., Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Warmer preparation of hippocampal slices prevents synapse proliferation that might obscure LTP-related structural plasticity. Neuropharmacology. 52, 55-59 (2007).
- Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats. J. Neurosci. 19, 2876-2886 (1999).
- Kirov, S. A., Petrak, L. J., Fiala, J. C., Harris, K. M. Dendritic spines disappear with chilling but proliferate excessively upon rewarming of mature hippocampus. Neurociência. 127, 69-80 (2004).
- Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. J. Neurosci. Methods. 171, 181-125 (2008).
