Entomopathogene aaltjes-grondbewonende rondwormen die een brede waaier van insecten parasiteren. We tonen bemonsteringsmethoden voor de isolatie van deze nematoden uit de bodem met behulp van twee technieken: de insecten lokken en de gewijzigde White val, voor het herstel van nematoden uit bodemmonsters en geïnfecteerde insecten kadavers, respectievelijk.
Entomopathogene nematoden (aka EPN) vormen een groep van-grondbewonende nematoden die een brede waaier van insecten parasiteren. Deze aaltjes behoren tot twee families: Steinernematidae en Heterorhabditidea. Tot nu toe hebben meer dan 70 soorten beschreven in de Steinernematidae en er zijn ongeveer 20 soorten in de Heterorhabditidea. De nematoden hebben een mutualistische partnership met Enterobacteriaceae bacteriën en samen vormen ze fungeren als een krachtig insecticide complex dat een breed scala aan soorten insecten doodt.
Hierin, richten we ons op de meest gebruikte technieken in aanmerking komen voor het verzamelen van EPN uit de bodem. Het tweede deel van deze presentatie richt zich op de insecten lokken techniek, een veel gebruikte aanpak voor de isolatie van EPN uit bodemmonsters, en de gewijzigde Witte trap techniek die wordt gebruikt voor het terugwinnen van deze nematoden uit besmette insecten. Deze methoden en technieken zijn belangrijke stappen voor de succesvolle oprichting van EPN cultgelen in het laboratorium en ook de basis vormen voor andere bioassays dat deze nematoden beschouwen als modelorganismen voor onderzoek in andere biologische disciplines. De in deze presentatie technieken overeenkomen met de uitgevoerde en / of door de leden van SP De laboratorium als die beschreven door verschillende auteurs.
Veel nematoden worden geassocieerd met insecten en hun gastheer interacties variëren van gunstig schadelijk. Hierin, richten we ons op een groep van nematoden die ziekteverwekkers van insecten, ook wel bekend als entomopathogene nematoden (of EPN). Twee nematode families behoren tot deze groep van nematoden: Steinernematidae en Heterorhabditidea 11,13. Hun pathogene effect is in feite door hun interactie met facultatief anaërobe darmbacteriën (Xenorhabdus bacteriën associëren met steinernematids en Photorhabdus bacteriën associëren met heterorhabditids) 2 toegekend. De bacteriën worden gevectoriseerd van de ene host naar de andere insecten door de enige vrij levende aaltjes moment de derde-fase infectieuze juveniele (ook bekend als dauer jeugdcriminaliteit, infectieuze jeugdige of IJ), die leeft in de bodem. Eenmaal binnen het insect, de aaltjes laat de bacteriën in hemolymph het insect, die het insect host door massale bloedvergiftiging doden. De bacteriën ookdegraderen weefsels van het insect en word voedselbron de aaltjes ', waardoor ze om te rijpen en zich te vermenigvuldigen. Meestal een of twee generaties van volwassen nematoden worden geproduceerd binnen het insect kadaver. Het nageslacht van de laatste generatie volwassen reassociates met enkele bacteriële cellen in een meer gespecialiseerd wijze dan hun vorige voeding relatie, en voeden deze cellen in de darmen zoals zij uit te gaan van de insecten karkas in de grond waar andere insecten zullen wachten tot parasiteren 6,11,14 (figuur 1).
Sinds hun ontdekking in 1927, hebben EPN beschouwd als waardevolle alternatieven voor chemische bestrijdingsmiddelen als ze een breed scala aan insecten die landbouwongedierte 3,4,5 zijn kunnen parasiteren. Echter, in de afgelopen twee decennia, deze nematoden en hun symbiotische bacteriën zijn erkend als een kneedbare modelsysteem voor het bestuderen van biologische, ecologische en evolutionaire aspecten van gastheer-microbe Interactio14 ns.
Het doel van deze presentatie is om de methoden en technieken het meest gebruikt voor de bemonstering en de isolatie van EPN bodem vertonen. Een verscheidenheid aan instrumenten is beschikbaar en kan worden gebruikt voor het verzamelen van bodemmonsters inclusief: bodem corers, troffels, post-gatengravers, grondboren, bemonstering buizen, met de hand schoffelen, onder anderen (figuur 2).
Afhankelijk van het doel van het onderzoek kunnen twee monsters strategieën beschouwd: a) gestratificeerd, b) steekproefsgewijze (figuur 3). De gestratificeerde steekproef wordt meestal gebruikt als onderdeel van een intensieve studie in een specifieke of demarked gebied gedurende een bepaalde periode. In het algemeen wordt een transect demarked en bodemmonsters genomen vastgelegd intervallen in het transect gedurende een tijdsperiode (figuur 3A) 15. De aselecte steekproef wordt in het algemeen toegepast bij het scherpstellen op een uitgestrekt gebied. Deze bemonstering strategie werd gebruikt voor het bestuderen van de diversiteit van EPN from een groot geografisch gebied of regio (Figuur 3B) 12. Een aantal factoren kunnen worden beschouwd, afhankelijk van de focus van de studie, waaronder een diverse waaier van verhogingen, bodemtexturen en habitats (bv., Akkers, bossen, weilanden, parken, zeekusten, oeverstaten gebieden, etc.).
We tonen de insecten lokken techniek, die oorspronkelijk werd beschreven door Bedding en Akhurst 1 en staat voor een eenvoudige en selectieve alternatief voor het herstellen van EPN van bodemmonsters. Dit is een selectief procedure die is gebaseerd op de vooronderstelling dat de nematoden (IJ fase) wordt aangetrokken door een insect gastheer en het parasiteren. Deze techniek kan ook worden beschouwd voor isolatie van andere insecten pathogenen zoals schimmels, bacteriën en 8,10.
We tonen ook gemodificeerde Witte trap techniek die wordt gebruikt voor het ophalen nematode nakomelingen van geïnfecteerde insect gastheren 7,14. Dit is een moeiteloze voldaanhod dat het voordeel van het ophalen van een 'schone' nematode nakomelingen vrij van vuil uit de vernederende insect kadavers biedt.
Tenslotte, de beschreven en in dit artikel technieken overeen met die bedacht en / of uitgevoerd en in ons laboratorium die beschreven door verschillende collega's en medewerkers.
Dit is de eerste demonstratie van twee vormen die een aantal technieken die algemeen worden gebruikt voor het bestuderen EPN en hun symbiotische bacteriën beschrijven. Deze technieken vormen belangrijke stappen voor de succesvolle oprichting van EPN culturen in het laboratorium en vormen tevens de basis voor andere bioassays die EPN in dienst als modelorganismen voor onderzoek.
Diverse bodemonderzoeken van EPN hebben aangetoond dat hun omvang en de verspreiding kan variëren over seizoenen,…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen het verleden leden van de voorraad lab bedanken: Sam-Kyu Kim, Kathryn Plichta en Victoria Miranda-Thompson voor hun bijdragen aan de verbetering van vele van deze protocollen. Wij erkennen de National Science Foundation steun (subsidies IOS-0840932 en IOS-0724978) SP Stock.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Galleria mellonella | Timberline | http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG | for insect baiting technique |
Filter Paper, 55mm Grade 1 Cellulose | Whatman/VWR | 28450-048 | infection chamber and White trap assembly |
60 x 15 mm Petri Dishes | VWR | 25384-092 | infection chamber and White trap assembly |
100 x 15 Petri Dishes | VWR | 25384-088 | infection chamber and White trap assembly |
ZIPloc Plastic Bags | Ace Hardware or local hardware store | N/A | soil sampling |
Mechanical Pipettor P1000, P200 ml | VWR | 89130-562; 89130-566 | infection chamber and White trap assembly |
pippetor tips 1000ml, 200 ml | VWR | 16466-004 ; 53510 | infection chamber and White trap assembly |
Bleach | Ace Hardware or local hardware store | N/A | soil sampling , desisnfecting |
Sodium Hypochlorite | Ace Hardware or local hardware store | N/A | soil sampling , desisnfecting |
70% Ethyl alochol | AAPER | 17212945 | soil sampling , desisnfecting |
Shovels | Ace Hardware or local hardware store | N/A | soil sampling |
Tubular soil sampler | Accuproducts | N/A | soil sampling |
Soil Probe, long handle | Nupla | PRB4T 69401 Classic | soil sampling |
Measuring tape | Ace Hardware or local hardware store | N/A | soil sampling |
Flagging tape, various colors | Ace Hardware or local hardware store | N/A | soil sampling |
tissue culture flasks | VWR | Falcon, 29185-304 | White trap, collection of EPN |
wash bottles, Polyethylene, Wide Mouth | VWR | 16650-107 | White trap, collection of EPN |