臨床応用のためのヒト羊膜上皮細胞の単離、凍結保存と文化
Summary
We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.
Abstract
Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents.
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.
Introduction
そのような胎盤などの周産期の供給源に由来する細胞は、胎盤膜、臍帯および羊水は再生医療1,2のための細胞の潜在的な供給源として研究者や臨床医から注目を集めている。この関心の理由は、これらの細胞型すべてが可塑性および免疫調節機能3、彼らの潜在的な治療への応用の基礎となる性質をある程度持っていることである。
HAECを回生細胞物質の豊富な潜在的な源を提供する、用語または早産羊膜4に由来することができる不均一な上皮細胞集団である。細胞療法として魅力HAECをを作る特性は、それらの多能、低い免疫原性、および抗炎症性を含む。 HAECをはcardiom（中胚葉系統に分化する能力、in vitroおよびin vivoの両方で非常に多能性であることが判明しているyocytes、筋細胞、骨細胞、脂肪細胞）、内胚葉系統（膵臓細胞、肝細胞、肺細胞）および外胚葉系統（毛髪、皮膚、神経細胞とアストロサイト）5-10。
安心させる、彼らの多分化のHAECをもかかわらず、腫瘍を形成またはin vivoで腫瘍の発達を促進するためのいずれか表示されません。さらに、HAECを、クラスIIヒト白血球抗原（HLAは）8の低いレベルで発現する、特権免疫がある。このプロパティは、おそらく免疫適格サル、ウサギ、モルモット、ラット、およびブタ11-13を用いた研究において実証されるように、同種および異種移植後の免疫拒絶を回避する能力の基礎となる。 HAECを、強力な免疫調節および免疫抑制のプロパティを表示し、したがって、自己免疫疾患の治療における潜在的な臨床応用のための重要な実用的な利点を提供する。 HAECをは、先天性および適応免疫システムの両方に免疫調節機能を発揮すると考えられている。上のメカニズムのeは、免疫調節因子の14の分泌を介して行われ、提案した。
前臨床動物疾患モデルでHAECを、現在のアプリケーションは、脳卒中、多発性硬化症、肝疾患、糖尿病、慢性及び急性の肺疾患の治療が含まれる。研究者は、彼らの独特の特性に起因する脳卒中後の脳の炎症を処置するためにHAECをを使用することに関心を示している。 HAECを、彼らは、生着までの60日間生存、ニューロンへの分化、炎症を減少させ、神経疾患15の動物モデルにおいて、損傷した中枢神経系組織の再生を促進することができ、血液脳関門を通過することができるという証拠がある。
HAECを、多発性硬化症の発症および進行に寄与する複数の病理学的経路を標的とし、逆転する機能を提供します。例えば、前臨床動物試験からの結果は、HAECを強く免疫抑制性であることを示唆していると潜在的に末梢免疫寛容を誘導し、継続的な炎症反応を逆にすることができます。 HAECをまた、インビボで神経細胞に分化し、神経栄養因子16の広大な配列の分泌を介して内因性の神経再生を増強する能力を有することが示されている。
ヒト及びげっ歯類羊膜上皮細胞は、既に、動物モデルにおける肝疾患の治療のためのそれらの治療有効性を実証している。縮小肝細胞アポトーシスに伴う肝臓中の生存HAECを生着に肝疾患、HAEC移植リードの四塩化炭素による損傷誘発モデルにおいて、肝線維症、炎症および17を減少させた。
HAECを、インスリンとグルコーストランスポーターなどの表現膵臓の要因に刺激することができる。いくつかの研究は、糖尿病マウス18で血中グルコースレベルを復元するHAECをする可能性を検討した。投与したマウスでは、HAECをは、両方の動物の体重および血中グルコースレベルは、細胞の注射後に正常レベルに低下した。これらの研究は、糖尿病の治療のためのHAECを使用するための強力なケースを提示する。
HAECを、成人および新生児モデル19の両方で実験的な急性および慢性の肺損傷の防止と修復において実績のある役割を担っている。これらの研究は、HAECをが嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギュレータ（CFTR）、嚢胞性線維症を有する患者20に変異しているイオンチャネルを含む複数の肺癌関連タンパク質を発現する機能的な肺上皮細胞にin vitroで分化することがわかった。 HAECを負傷が成人および新生児の肺に送達された場合も、それらは、好中球、マクロファージおよびリンパ球21-23を含む肺白血球補充を、還元、宿主免疫細胞の調節を介して、それらの修復効果を発揮する。
彼らの豊富を考えると、安全記録、および複数の疾患のための実証済みの臨床応用、HAECをを使用した臨床試験は避けられない。臨床治験にHAEC療法の翻訳を加速させることを目標に、私たちは現在の適正製造基準（cGMPの）ガイドラインに従って動物製品の無試薬を用いて、臨床試験のための適当な方法で培養HAECをし、分離し凍結保存とする方法を開発。
私たちは、このプロトコルを私たちは動物由来の試薬6を使用してHAECをを分離することに成功し使用していた以前に公開されたプロトコルをベース。我々は、動物製品を含まない試薬で動物由来の製品を置き換えるために、元のプロトコルを変更し、その後の最適化は、細胞収量、生存率および純度を最適化するために行った。私たちの目標は、ヒト臨床試験用電池製造のための規制基準に準拠したいプロトコルを開発することであった。
Protocol
Representative Results
Discussion
この方法の成功に重要な影響を与えることができるいくつかの重要なパラメータがある。 HAECを単離する前に、最大3時間胎盤または羊膜の貯蔵はロジスティックまたはスケジューリングの目的のために望ましいことがある、しかしそれは、組織ができるだけ早く処理されることをお勧めします。組織を保存する場合は、ストレージが羊膜膜の解剖と洗浄後に実施することをお勧めします。羊?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge financial support from the Victorian Government’s Operational Infrastructure Support Program.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Collection Kit | |||
| Stripping tray | Fisher Scientific | 13-361B | |
| Liberty Dressing Forcep, pointed 13cm | Fisher Scientific | S17329 | |
| Scissors – Sharp/Blunt Straight | Fisher Scientific | NC0562592 | |
| Sterile latex gloves | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| Protective Apparel (Gown) | U-line | S-15374-M | |
| Protective Apparel | |||
| Isolation gowns | U-line | S-15374-M | |
| Sterile latex gloves | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| General purpose face mask | Cardinal Health | AT7511 | |
| Bonnets | Medline | CRI1001 | |
| Shoe covers | U-line | S-7873W | |
| Media and Reagents | |||
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175095 | without calcium or magnesium |
| TrypZean(animal product–free recombinant trypsin) | Sigma Aldrich | T3449 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 1g/50mL | Sigma Aldrich | T6522 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | |
| Trypan blue reagent | Life Technologies | 15250-061 | |
| anti-EpCam-PE | Miltenyi Biotec | 130 – 091-253 | |
| PE-isotype control | Miltenyi Biotec | 130-098-845 | |
| anti-CD90-PeCy5 | BD Pharmingen | 555597 | |
| PeCy5-isotype control | BD Pharmingen | 557224 | |
| anti-CD105-APC | BD Pharmingen | 562408 | |
| APC-isotype control | BD Pharmingen | 340754 | |
| Collagen Type VI | Sigma Aldrich | C7521 | |
| Consumables | |||
| 50mL graduated pipette | BD/Falcon | 356550 | |
| 10mL graduated pipette | BD/Falcon | 356551 | |
| 5mL graduated pipette | BD/Falcon | 356543 | |
| 50mL falcon tubes | BD/Falcon | 352070 | |
| 15mL falcon tubes | BD/Falcon | 352096 | |
| 15-cm petri dishes | Corning | 351058 | |
| 70-μm filters | BD/Falcon | 352350 | |
| 0.22-μm filters | Millipore | SLGV033RS | |
| 1ml Pipette tips | Fisherbrand | 02-707-401 | |
| 200ul Pipette tips | Fisherbrand | 02-707-409 | |
| 20ml Syringe | BD/Medical | 309661 | |
| Plastic spatula | Fisher Scientific | 14-245-97 | |
| Plastic weighing boat | Fisher Scientific | 02-202-102 | |
| Cryo vials | Nunc | 377267 | |
| Equipment | |||
| Mr Frosty | Fisher Scientific | A451-4 | |
| Biohazard Cabinet |
Referências
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