효력을 더 Hsp104 변종 사용 효모 Proteinopathy 모델을 분리
Summary
Yeast proteinopathy models are valuable tools to assess the toxicity and aggregation of proteins implicated in disease. Here, we present methods for screening Hsp104 variant libraries for toxicity suppressors. This protocol could be adapted to screen any protein library for toxicity suppressors of any protein that is toxic in yeast.
Abstract
Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic lateral sclerosis, and α-synuclein, implicated in Parkinson’s disease, are toxic and form cytoplasmic aggregates in yeast. These features recapitulate protein pathologies observed in patients with these disorders. Thus, yeast are an ideal platform for isolating toxicity suppressors from libraries of protein variants. We are interested in applying protein disaggregases to eliminate misfolded toxic protein conformers. Specifically, we are engineering Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast that is uniquely capable of solubilizing both disordered aggregates and amyloid and returning the proteins to their native conformations. While Hsp104 is highly conserved in eukaryotes and eubacteria, it has no known metazoan homologue. Hsp104 has only limited ability to eliminate disordered aggregates and amyloid fibers implicated in human disease. Thus, we aim to engineer Hsp104 variants to reverse the protein misfolding implicated in neurodegenerative disorders. We have developed methods to screen large libraries of Hsp104 variants for suppression of proteotoxicity in yeast. As yeast are prone to spontaneous nonspecific suppression of toxicity, a two-step screening process has been developed to eliminate false positives. Using these methods, we have identified a series of potentiated Hsp104 variants that potently suppress the toxicity and aggregation of TDP-43, FUS, and α-synuclein. Here, we describe this optimized protocol, which could be adapted to screen libraries constructed using any protein backbone for suppression of toxicity of any protein that is toxic in yeast.
Introduction
효모 proteinopathy 모델은 근 위축성 측삭 경화증 (ALS) 및 파킨슨 병 (PD) 1-3 포함한 단백질 미스 폴딩 장애 개발되어왔다. ALS 환자에서 misfold 단백질 TDP-43 및 FUS,의 발현은, 효모 1, 2에서 세포질 응집체를 형성하는 독성 및 mislocalize 있습니다. 마찬가지로, PD에 연루되어 α – 시누 클레인 (α-SYN)의 표현은, 독성 및 mislocalizes 효모 3 세포질 응집체를 형성 할 수 있습니다. 이러한 기능은 이러한 장애 4,5 환자의 표현형을 요점을 되풀이. 따라서, 효모 모델을 방지하거나 이러한 표현형 2,6-13 역 단백질이나 작은 분자 스크리닝을위한 유용한 플랫폼을 제공합니다. 저자들은 TDP-43, FUS 및 α-SYN에 집계 및 독성을 반전 할 수있는 단백질의 개발에 관심이 있습니다. 우리는 Hsp104, 모두 FR 단백질을 disaggregating의 고유 할 수있는 효모에서 AAA + 단백질에 초점효모에서 톰 비정질 단위 및 아밀로이드는 아직 더 인간의 상동 (14, 15)이 없습니다. Hsp104 미세 내생 효모 프리온을들을 분해하도록 조정하고 일반적으로 16, 17가 발생하지 인간의 신경 퇴행성 질환에 연루 기판을들을 분해하는 제한된 능력을 가지고 있습니다. 따라서, 우리는 efficaciously이 인간의 기판을들을 분해 할 수있는 Hsp104의 향상된 버전을 설계하는 것을 목표로하고 있습니다. Hsp104는 오류가 발생하기 쉬운 PCR을 사용하여 변형이를 위해, 우리는 큰 라이브러리를 구성; 이 라이브러리는 효모 proteinopathy 모델 (17)를 사용하여 검사를 할 수 있습니다. Hsp104 (17) 매우 큰 것처럼 우리는 라이브러리를 구성하고 심사에 도메인 타겟 접근 방식을 채택했습니다. 유사한 접근법이 다른 도메인을 선별하기 위해 사용될 수 있지만 우리는 처음, 중간 도메인 Hsp104 17 (MD)에 집중했다. 예컨대, 나머지는 표면 디스플레이, 같은 대체 기술과 반대로 이러한 모델은, 직접적 disaggregase 활성 스크리닝 에이블18 바인딩 모니터링을위한 사용하기 ricted.
우리의 프로토콜은 두 심사 단계 (그림 1)을 기반으로합니다. 첫째, 효모 질병 기판의 독성을 억제 Hsp104 변이체가 선택된다. 이렇게하려면 Hsp104 변종과 질병 관련 기판은 Δ의 hsp104 효모에 cotransformed된다. 우리는 야생 형의 부재 (WT) Hsp104 17 Hsp104 시퀀스 공간을 탐험 Δ의 hsp104 효모를 사용합니다. 중요한 것은, Hsp104의 삭제는 효모의 α-SYN, FUS, 또는 TDP-43 독성에 영향을주지 않으며, Hsp104 (WT)의 표현은 최소한의 구조 1,13,17을 제공합니다. 효모는 양쪽 단백질의 발현을 유도하는 유도 배양액에 도금된다. 식민지의 질병 관련 기판 협의 성장의 독성을 억제 Hsp104 변종을 품고 효모. 식민지 독성 다이를 억제하지 않는 변종을 유지하면서 이러한 변형은, 추가 분석을 위해 선택됩니다. 그러나,오탐 (false positive)이 화면에 상당한 문제가 있습니다. TDP-43, FUS 및 α-SYN의 식으로 표현되는 Hsp104 변형과 관련이없는 독성의 자발적인 유전자 억제의 모양에 대한 강력한 선택적 압력을 생성하는, 매우 독성이 있습니다. 따라서, 우리는 이러한 비특이적 독성 억제 (17)를 제거하기 위해 상대적으로 높은 처리량입니다 보조 화면을 사용했다. 이 보조 화면에서 선택 효모 Hsp104 플라스미드 (19)에 대한 선택에 대응하기 위해 5 Fluorootic 산 (5-FOA)로 처리된다. 균주 후 기판의 독성 Hsp104 플라스미드의 손실 후 복원 될 수 있도록 분석을 통해 안보 (TDP-43, FUS, 또는 α-SYN) 독성 기판에 대한 평가된다. 따라서, 독성이 보조 화면에 복원되는 효모는 아마도 원래 인해 Hsp104 변종의 존재에 대한 독성 억제를 표시. 이러한 효모 '히트'로 표시되고 Hsp104 플라스미드는되어야회수 Hsp104 유전자 17 (도 1)의 변이를 식별하는 서열. 모든 히트 곡은 다음 독성 억제에 대한 재검사 후 독립적으로 돌연변이를 구성하는 부위 특이 적 변이를 사용하여 재확인해야한다. 이 프로토콜에 대한 잠재적 인 응용 프로그램은 광범위하다. 이러한 방법을 이용하여 단백질의 임의의 타입의 라이브러리가 효모의 독성 어떤 기질 단백질의 독성을 억제하는 변형에 대해 스크리닝 될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서 우리는 효모 proteinopathy 모델을 사용하여 질병 관련 기판의 독성을 억제하는 효력을 더 Hsp104 변종을 분리에 대한 우리의 접근 방식을 제시한다. 이 방법을 사용하여, 변형의 큰 라이브러리 만 제한 -5- FOA 보조 스크린을 통과 변이체의 개수 인 상태, 높은 처리량 스크리닝 할 수있다. 96 웰 형식으로 다음 단계를 수행함으로써, 우리는 정기적으로 1-2주의 과정을 통해 5-FOA 단계에서 한 번에 2…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Sue Lindquist, Aaron Gitler, and Martin Duennwald for kindly sharing reagents. Our studies were supported by: an American Heart Association Post-Doctoral Fellowship (M.E.J); NIH Director’s New Innovator Award DP2OD002177, NIH grants R21NS067354, R21HD074510, and R01GM099836, a Muscular Dystrophy Association Research Award (MDA277268), Packard Center for ALS Research at Johns Hopkins University, Target ALS, and an Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging Award (J.S.).
Materials
| Table of Specific Materials/Equipment | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GeneMorphII EZClone Domain Mutagenesis Kit | Agilent | 200552 | |
| 150mm Petri dishes | Falcon | 351058 | |
| 5-Fluorootic Acid | Research Products International | f10501-5.0 | |
| 96-DeepWell 2mL Plates | Eppendorf | 0030 502.302 | |
| 96 bold replicator tool | V&P Scientific | vp-404 | |
| ExoSAP-IT | Affymetrix | 78200 |
Referências
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