MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.
ميرنا الاستنساخ والإنتاجية العالية التسلسل، وصف مير تسلسل، تقف وحدها كنهج Transcriptome على صعيد لتحديد miRNAs لقرار النوكليوتيدات واحد. هذه التقنية تلتقط miRNAs عن طريق ربط محولات 3 'و 5' قليل النوكليوتيد إلى جزيئات ميرنا وتتيح دي نوفو ميرنا الاكتشاف. اقتران قوية مع الجيل المقبل من منصات التسلسل، وكان مير تسلسل دور فعال في دراسة ميرنا البيولوجيا. ومع ذلك، تحيزات كبيرة أدخلها قليل النوكليوتيد خطوات ربط منعت مير تسلسل من يجري استخدامها كأداة الكميات دقيقة. وتظهر الدراسات السابقة أن التحيز في وسائل مير يليها الحالية غالبا ما تؤدي إلى عدم دقة ميرنا الكمي مع أخطاء تصل إلى 1،000 أضعاف لبعض miRNAs 1،2. لحل هذه التحيزات الكشف عنها من قبل RNA ربط، قمنا بتطوير طريقة RNA الصغير الذي يؤدي إلى ربط الكفاءة ربط أكثر من 95٪ لكل 3 'و 5' خطوات عملية ربط. هذا القياس ايمأثبتت طريقة البناء باستخدام مكتبة miRNAs الاصطناعية متساوي المولية أو المختلطة بشكل مختلف، ينتج باستمرار يقرأ الأرقام مع الانحراف شقين من أقل من القيمة المتوقعة. وعلاوة على ذلك، تسمح هذه الطريقة ذات الكفاءة العالية مير تسلسل دقيق الجينوم على نطاق ميرنا التنميط في الجسم الحي من مجموع عينات الحمض النووي الريبي (2).
تم تطبيق المنهجيات القائمة على الإنتاجية العالية التسلسل على نطاق واسع في العديد من العينات البيولوجية في السنوات الأخيرة توسع إلى حد كبير فهمنا لتعقيدات النظم البيولوجية الجزيئية 3،4. ومع ذلك، وإعداد عينات الحمض النووي الريبي عن الإنتاجية العالية التسلسل غالبا ما يضفي التحيزات الكامنة محددة لالمنهجية المستخدمة، مما يحد من إمكانية الاستفادة من هذه التقنيات القوية. تم هذه التحيزات طريقة محددة موثقة جيدا عن القائم على الربط، صغير RNA الاستعدادات مكتبة 1،2،5،6. هذه التحيزات تؤدي إلى تباين 1000 أضعاف في ما يلي أرقام لmiRNAs الاصطناعية متساوي المولية، مما يجعل الاستدلال من وفرة ميرنا من البيانات التسلسل متغير بعنف والخطأ عرضة.
وقد وثقت الدراسات التي تركز على خصائص T4 ligases RNA المستمدة فج أن الإنزيمات تظهر تفضيلات القائمة على النوكليوتيدات 7، والذي يعبر عن المكتبات متحيزة كما في الإنتاجية العالية التجارب التسلسل <sتصل> 1،2،8. من أجل تقليل التحيزات الكشف عنها من قبل ligases RNA، وقد استخدمت استراتيجيات متعددة؛ الجزيئات الازدحام 9 العشوائي تسلسل النوكليوتيدات على المحول الذي هو الأقرب إلى الموقع ربط 6، واستخدام تركيزات عالية من محول ربط 2. من خلال الجمع بين هذه الأساليب الثلاثة قمنا بتطوير تدفق العمل لإعداد متحيز المكتبات RNA صغيرة تتلاءم مع التسلسل الإنتاجية العالية (الشكل 1). للمقارنات مباشرة بين البروتوكولات الحالية وأسلوبنا الأمثل، يرجى الرجوع إلى تقريرنا الأخير 2. هذه الطريقة الأمثل ينتج كفاءات ربط تزيد عن 95٪ في كل 3 'و 5' الخطوات ويسمح للربط متحيز من جزيئات الحمض النووي الريبي من عينات صغيرة الاصطناعية والبيولوجية 2.
منهجية الموصوفة هنا يجعل من استخدام العديد من المتغيرات الرئيسية لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة ربط، وهي تركيزات عالية من PEG، واستخدام linkers العشوائية، وتركيز عال من linkers 2،6،9. هذا النهج يسمح مكتبات التسلسل الكمية موثوق من مجموع عينات الحمض النووي الريبي (2). قم?…
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank members of the Yi laboratory especially Zhaojie Zhang for fruitful discussions regarding linker design and ligation efficiencies, as well as the American Cancer Society for supporting this work through a postdoctoral fellowship (#125209) to J.E.L. Research reported in this publication was also supported by the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health under Award Number R01AR059697 (to R.Y.) and a research grant from the Linda Crnic Institute for Down Syndrome. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
3' Linker (5' phosphorylated, 3' blocked) | Integrated DNA Technologies | custom | |
5' Linker | Integrated DNA Technologies | custom | 5' blocked, HPLC Purified |
T4RNL2 (1-249 K227Q) | New England Biolabs | M0351S | Specialized for ligation of pre-adenylated DNA adapters |
10X Ligation Buffer (without ATP) | New England Biolabs | Included with M0351S | |
10X Ligation Buffer (with ATP) | New England Biolabs | Included with M0204L | |
RNaseOUT | Invitrogen | 10777-019 | |
Polyethylene Glycol (mol. Wt. 8000) | New England Biolabs | Included with M0204L | |
Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | We have found water collected from a distillation apparatus to be of equvalent quality. |
T4RNL1 | New England Biolabs | M0204L | |
Superscript III RT kit | Invitrogen | 18080-051 | |
Phusion PCR kit | New England Biolabs | M0530S | |
Illumina RP1 Primer | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
Illumina RT Primer | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
Illumina Index Primer(s) | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
40% Acrylamide | Fisher Scientific | BP14081 | |
Urea | Sigma Aldrich | U6504 | |
Ammonium persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | |
Tetramethyethylenediamine (TEMED) | Sigma Aldrich | T9281 | |
2X Denaturing RNA loading buffer | New England Biolabs | Included with M0351S | |
Razor blades | VWR | 55411-050 | |
SpinX Centricon Tubes | Costar | CLS8161 | |
Low Retention Microfuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
Sybr Gold | Invitrogen | S-11494 | |
Adenylation Kit | New England Biolabs | E2610L |